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(無題) 削除/引用 No.4471-9 - 2015/10/09 (金) 11:10:35 - おお 血清はなんかきいたことあるな。RNase freeにこだわるならシリコナイズされてnuclease freeで売られたものとかどうかなぁ。。。。 RNAとるだけなら13000rpmでぶんぶん回してもいいんじゃない? で固定後にRNA抽出ってまあ組織ではそれしか選択肢がなくてやられることはあるけど、、、どうかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.4471-8 - 2015/10/09 (金) 08:53:51 - mon 使用したことがないので無責任モードですが、セルローションって商品は目的に合っているような？http://www.zenoaq.jp/cellbanker/ja/cellotion.html

(無題) 削除/引用 No.4471-7 - 2015/10/09 (金) 01:53:49 - ルナ 別スレ（4470）で質問しているものです。 当方では固定していませんが、細胞吸着が少ないらしい、タンパク低吸着のプロテオセーブという商品の1.5ｍｌに受けています。セルソーターは当方でもソニーです。共焦点顕微鏡で、とれた細胞を確認できています。 ですが、とれるRNA量が少なくて、困っていて、セルソーターには見切りをつけて、別スレ（4470）のような質問をしています。 当方では初代細胞を使っていますが、癌細胞ならうまくいくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4471-6 - 2015/10/08 (木) 18:04:02 - 手 お返事ありがとうございます。 血清で処理するというのがメジャーな方法みたいですね。 実際に試してみます。有難うございます。 チューブにTrizolなどを直接入れておくという案も確かにあるのですが、ソートされた液量に制限がかかってしまうことや、固定細胞からの核酸抽出においては収量を上げるために前処理を行っていますので、直接というのは難しいのが現状です。 詳しくは肝癌細胞です。 語弊があったのならば申し訳ありません。 Primary hepatocyteでは抗体の当たりが悪いのか、固定→透過処理の条件がそぐわないのか、自分の系では検出することが出来ませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4471-5 - 2015/10/08 (木) 17:35:44 - う 固定した細胞は落ちにくいですよね。 私はBSAをキャリアとして加え、さらに遠心して回収しています。 BSAを加えないとほとんど落ちないですね。 私ならdirectにトリゾール等にsortします。 後学のために教えてください。 100 mm dishの肝細胞とのことですが、primary hepatocytesを培養されてるということですか？

(無題) 削除/引用 No.4471-4 - 2015/10/08 (木) 15:51:27 - アンメルツ横横 ・チューブを血清で処理することにより細胞の付着を防止する もしくは ・1.5mLチューブに核酸抽出薬（たとえばTRIzolやQiagen RNeasyのBuffer RLT等）を入れたものでソートされた細胞を直接受ける

(無題) 削除/引用 No.4471-3 - 2015/10/08 (木) 14:54:41 - 手 >[Re:2] ggさんは書きました : > 遠心のgはどのくらい？ > その後のアプリケーションは？ 遠心は15mlのチューブのまま1500rpm(400gくらい)で5minです。 試しに3500rpm(2400gくらい）まで上げてみましたが結果は変わらないようです。 固定した細胞は核酸抽出に持って行きます。 遠心後上清を残り1.5mlになるまで除き、残りを再懸濁後1.5mlエッペンチューブに移し、再度3500rpmで5min遠心してから上清を除きます。

(無題) 削除/引用 No.4471-2 - 2015/10/08 (木) 14:48:54 - gg 遠心のgはどのくらい？ その後のアプリケーションは？

固定細胞におけるソーティング後の回収方法 削除/引用 No.4471-1 - 2015/10/08 (木) 14:45:44 - 手 肝細胞をPFAで固定し、TritonX100にて透過処理後、抗体を当てて細胞のソーティングを行っています。 ソーターはSONYのSH800を使用しており、毎回100mmのdishコンフルの細胞から10〜20%ほどのポピュレーションをソートしています。 ソーターが示すソート後の細胞数やソート前の細胞数から算出したソートされた細胞数ではソート後にペレットダウンしても十分目視可能な量が得られるはずなのですが、実際にはほとんど何も見えないレベルまで細胞数がロスっています。 ソートの回収には15mlのファルコンチューブにPBSやメディウムを12ml程度入れたものを使用しています。回収後のチューブを顕微鏡で無理矢理観察すると、それなりの数の細胞が見えるのですが、どうやら遠心後にペレットとして落ちてこないのか、壁面に張り付いてしまっているのか、回収効率がガクッと落ちます（固定細胞はペレットになりにくいですが、それを踏まえてもです）。 そこで質問なのですが、固定した細胞をソートし回収してくる場合、効率よくサンプルを回収できる良い方法をご存じの方はいらっしゃいませんでしょうか。 宜しくお願いします。

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