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biPTcSpcegO 削除/引用 No.4456-18 - 2017/10/24 (火) 00:42:23 - JimmiNil JHxoJ2 http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

(無題) 削除/引用 No.4456-17 - 2016/08/10 (水) 07:52:16 - Loach ハイブリドーマでコンタミからレスキューした経験があります。 Transwellの上槽に細胞を添加してポアサイズの違いを利用してある程度細菌を落とした後、Percollで分離して再度培養したら細菌が生えてくる様子はありませんでした。抗生剤はアンホテリシンBを追加したぐらいだったかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4456-16 - 2016/08/09 (火) 19:16:05 - B 増殖性高い細胞なら、いっそ、抗体くっつけてFACSでsortingしてしまうとかね。 無茶苦茶キレイに流路洗浄しないといけないし、バレたら怒られるだろうけど。 ……がっつりコンタミしてるならマイコはんも入ってると考えた方がいいから、完全には除去できないか。

(無題) 削除/引用 No.4456-15 - 2015/10/10 (土) 01:09:42 - pMP 邪道なやり方かもしれませんが、というより私はしたことはないので完全に他人事ですが、 どうでしょう、マウスの腹腔からマクロファージを含む、腹腔洗浄液を回収して、それをコンタミした細胞に加えてみては？＋ファンギソンありで。 コンタミした細菌や酵母、食べてくれんかしらん。 マクロファージやファイブロや他の腹腔内の血球系細胞は寿命があるので時期にしんでいきます。 みなさまどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4456-14 - 2015/10/05 (月) 14:17:12 - おお https://www.med.unc.edu/cfpulmcenter/files/Chapter%2018.pdf For fungus or yeast contamination, nystatin (Sigma-Aldrich, Cat. #N1638, 100 U/mL) and diflucan (25 μg/mL) can be added. diflucanはたぶん商品名でfluconazoleが一般名ではなかったかとおもいます。臨床で特に感染していたり、組織上の性質、病理的な状態などで常在菌やその他の菌が繁殖している場合があるので結構シビアに抗生物質をつかってcultureに持っていく場合があるようです。 fluconazoleかまたそれと同じ作用をもつketoconazoleは培養のコンタミネーションを防ぐ試薬としてどこかの試薬会社から売られていたと思ったのですが、、、今見つかりません。。。単なる化合物としては手に入ります。fluconazoleは今調べるとP450阻害作用もあるのでその辺も絡んでるのか、、、 くわえてinvivogenは違うユニークなものをうっているようです。

(無題) 削除/引用 No.4456-13 - 2015/10/05 (月) 13:16:44 - mon ちなみに、遺伝子組換え用の大腸菌株にはストレプトマイシン耐性遺伝子を有しているものが多いです。またplasmidにコードされているアンピシリン耐性遺伝子の産物（β-ラクタマーゼ)は、ペニシリンを分解します。 アンホテリシンBに関して、10-20ug/mLほどで細胞に影響が出ることが多いですが、5ug/mLだと酵母が死滅しないこともあるので悩ましいです（=使用しないがbest)。 せいぜい初代培養等で予防的に2.5-5ug/mLで使用するくらいかな。 酵母・カビ・細菌は大きさ・形状が全く異なるので、(位相差)顕微鏡で明確に区別出来ます。

(無題) 削除/引用 No.4456-12 - 2015/10/05 (月) 07:39:08 - ppt 本人だけの問題か、ラボ全体の問題かも重要。 インキュベーターやウォーターバス、培養室が汚い状態だといくらレスキューしても同じ事の繰り返しなので、根本的な改革が必要。 あと、大腸菌を気にするなら、ピペットを含む器具類は別にしておけばリスクは減らせます。

(無題) 削除/引用 No.4456-11 - 2015/10/05 (月) 02:20:12 - おお 細胞がそこそこあるなら、トリプシンではがして抗生物質いりのPBSで数回あらうてもあります。

(無題) 削除/引用 No.4456-10 - 2015/10/04 (日) 20:19:41 - mon お薦めしませんが、どうしてもrescueしなければいけない場合、 まずPBS(+)または培地で10回以上リンスして、可能な限りコンタミ菌を減らし、増殖培地に置き換えます。リンス時dishの縁に菌が残りやすいので注意してください（dishをゆっくり揺らし液が縁をなでるようにすると良い）。また念のためdishの外側（縁）をアルコールで消毒すると良いでしょう。 細菌なら抗生剤を加え、翌日残存菌が視認できるなら再度リンスして抗生剤入りの培地に置換します。残存菌が視認できるなら前記操作を繰り返します。さらに2-3日後、一部を抗生剤なしの培地で培養して、コンタミの有無を調べます。抗生剤で細菌は2-3日で死ぬようです。 酵母・真菌ならFungizon(念のため＋Gentacin）を用いて培養し、2-3日後培地交換して、さらに2-3日後一部を抗生剤なしの培地で培養して、コンタミの有無を調べます。酵母・真菌はなかなか死なないので、濃度を振ることが必要なときもあります（濃度が高いと細胞に空胞のようなものが出現することがあります）。 皆さんが指摘しているように、菌が出す毒素で細胞が変質している可能性や未知のコンタミ（増殖の遅い耐性菌、マイコプラズマ、ウィルス）が残存している可能性がありますので、注意して使用してください。とくに感染経路（皮膚？）を考えるとマイコプラズマも感染している可能性は高いです。

(無題) 削除/引用 No.4456-9 - 2015/10/04 (日) 16:49:57 - あqwせdrfちゅいお 抗生剤入れてるし、培地交換もするしで、コンタミしてても気がついてない人が実際には多いとおもう。菌いるけど細胞の増殖や実験結果に影響するほど増えてない、というのが現実ではないかとおもう。抗生剤で叩いても菌の完全な除去は困難と思う。

(無題) 削除/引用 No.4456-8 - 2015/10/04 (日) 02:27:35 - しろ 細胞培養しているとコンタミなのか細胞デブリスなのかいつも混乱します。なんだかすべてがコンタミしている気もしますし。正直大学の研究室レベルではペンスト入れてたところでコンタミさせないよう培養するなんて不可能じゃないかなと思っています。だったら元からペンストなしで培養して、目に見えるコンタミしたら起こしなおしたほうが安心じゃないかなー、なんて思ったり、いや、万が一の多少のコンタミもペンストでたたければ大丈夫だから入れておこうと思ったり。コンタミしていても日々培地を変えるわけですからなかなか発見できませんよね。みなさんそのまま実験に使っているのが現状なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4456-7 - 2015/10/02 (金) 21:56:58 - あqwせdrfちゅいお 抗生剤入れてても細菌や真菌が増えてしまうことはあります。抗生剤も効果が持続には限りがあるし（特に３７では）、たとえ抗菌スペクトルからみて有効でも押さえきれないこともあるし。コンタミは恥ずかしいことではありません。抗生剤で増殖がゆっくりの不顕性のコンタミを強拡大で観察して早期に見つけてとっとと処分して新しい細胞を準備できるのがプロフェッショナルです。

(無題) 削除/引用 No.4456-6 - 2015/10/02 (金) 07:47:40 - おお 効く、効かないの話だけで、実際rescueしたことはありません。 やるなら、treatment 用dishは常に加えておいて、treatment 用dishが大丈夫そうだったらそこからけいだいしたのをfreeにかえてコンタミがクリアーされているかどうか確かめるでしょう。でクリアーされていたらそれを増やせばいいし、されてなかったらtreatment 用dishは維持しておく。どうですかねぇ。。。うまくいくか本当のところよくわかりません。本当に初期の段階ならまだチャンスはあるかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4456-5 - 2015/10/02 (金) 07:37:21 - しろ monさん、おおさん、 ちなみにコンタミした場合におっしゃるようなGentamycinやカナマイシンを使用する場合、どのくらいの日数インキュベートされますでしょうか？（もちろん破棄して起こしなおすのが基本でしょうが、どうしてもレスキューしたい場合。）後学のためご経験を伺えればと思います。

(無題) 削除/引用 No.4456-4 - 2015/10/02 (金) 06:29:54 - おお バクテリアならわたしもGentamycinとカナマイシンをすすめますね。テトラサイクリンも加えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4456-3 - 2015/10/02 (金) 06:04:45 - mon 大きさから、酵母か細菌か判断出来ませんか？ 細菌なら、Gentacin (Gentamycin) 80-100ug/mLが抗菌スペクトルが広く割と万能です。培養細胞への影響もほとんど無いです。ただし、常用は耐性菌を増やすので危険です。 抗生剤を常用している環境（お薦めしないですが）なら、ペニシリン+ストレプトマイシンを、たま（交互に？）にカナマイシン25-50ug/mlに変えるのが良いでしょう。 なお、目に見えるコンタミした場合は、目に見えないマイコプラズマ等も同時に感染している可能性も考慮してください。

(無題) 削除/引用 No.4456-2 - 2015/10/02 (金) 02:29:35 - おお 相手がなんにしろ抗生物質だけでというのはけっこう難しいと思います。 原核生物ならかなり小さいので通常細胞を見ている顕微鏡では形もはっきりしない位小さいことがおおいです。スピロヘータあたりだと見てわかるかもしれません。 酵母は細胞より小さいことが多いですけど形は何とか見える子が多いです。バクテリアではたいていは増殖がはやくすぐにdishに一杯になってしまいますので、あさ気がついて培地をかえて抗生物質などを添加してもきかなければ昼にはもう終わってるぐらい増えてるかとおもいます。 酵母ならたぶんファンギゾンの次の世代の抗生物質が培養用にも出てると思いますが、今ちょっと思い出せません(その世代のものは酵母、カビ特異的な酵素阻害剤なので比較的細胞には毒性が少ないはずです)。 ただ抗生物質を入れるだけでうまくいくとは思えないので、培地を頻繁に変えたり、けいだいの時にパーコールなど使ってみたりしてなるべく今民が少ない状態にもっていって、場合によっては限界希釈で細胞だけのフラクションをとったりと、そうとう手の込んだことがひつようだろうし、そうしてもうまくいくとはかぎりません。 あとは周りに拡散するのもよくないのでその辺の配慮もしないといけませんよね。

ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギソンでも死なない菌 削除/引用 No.4456-1 - 2015/10/02 (金) 01:13:34 - 来ん民困った お世話になっております。 初代ファイブロブラストを飼っていますが、どうも細胞がコンタミしているようです。 当方、恥ずかしながらこれまでいくつかコンタミの経験があります。その際には培地が濁り、ディッシュの底一面に微粒な菌が生えているというものです。 ただし、今回のコンタミは、培地が白濁せず、ですが床一面に細かい微粒のものが広がっています。 ファイブロブラストの成長や生存には影響していないようです。 培養液にはペニシリン、ストレプトマイシンを加えていますが、酵母を疑い、先日アンホテリシンBを50または5 ug/mlで加えて観察してみました。すると高濃度の方では細胞ですら全滅してしまいましたが、よく論文で使われる低濃度の方では細胞の発育にも影響はありませんでしたが、細かい微粒のものに関しても増えているようなんです。 自分の手で不死化した細胞ですので、どうにかレスキューできればと思っていますが、果たしてこれら薬剤に抵抗性を持つ微生物はいるのでしょうか？ 当方別の実験でアンピシリン抵抗性大腸菌をプラスミドを構築する際には使っていますが。。それらのコンタミでしょうか。

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