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(無題) 削除/引用 No.4443-13 - 2015/10/11 (日) 04:28:55 - おお 一つ思い出して書こうとしながら、、、ネオマイシンはバクテリアのリボソームに阻害効果を示すわけで、同じような化合物でgentamycinはやはりバクテリアを対象とした化合物ですが、このgentamycinはマンマルの細胞でstop codonのreadthroughを起こすことがあって、それを利用してmutationで起こるprematureなtranslationのstopを防ぐという試みがありますね。

(無題) 削除/引用 No.4443-12 - 2015/10/07 (水) 12:55:50 - 横からです みなさん、横からの質問にも丁寧にご回答いただきありがとうございます。 はい。その通りで、試薬棚にG418が見つからなかったので、microbiotaをされてる同じラボの先生からNeomycinをいただき、使用していました。293細胞で確か400ug/ml程度だったかと記憶しています。安定発現細胞株がきちんとえられました。 バクテリア得意的と言われているものだったんですね。しりませんでした。 pcDNA3.1を使いましたが、ネオマイシン抵抗性遺伝子が入っていましたし、哺乳動物発現用のプラスミドと見えましたので、ネオマイシンを疑うことなく使用しました。 実は明日、A431に一過性導入して、その後、ネオマイシンで選択予定でした。この際の濃度は、文献で調べたものです。そもそもG418って高くないですか？ネオマイシンに比べて。。

(無題) 削除/引用 No.4443-11 - 2015/10/07 (水) 12:25:27 - gg 教科書的にはneomycinは70Sを阻害するけど80Sを阻害せず、G418は80Sも阻害するから真核細胞でも効果がある、ということですが、特異性の問題なのでneomycinも80Sに作用しうる可能性も散見します。ただ、明確な証拠のデータを見つける事はできなかったので、どこまで本当かわかりません。 大量に入れればneomycinでもセレクションができるかもしれませんけど、素直にG418を使用した方が無難かと。

(無題) 削除/引用 No.4443-10 - 2015/10/07 (水) 09:06:09 - おお あ、でもNeomycinでセレクションができたのですか。。。ほかにその様な経験があるひとはいるんでしょうか。。。。

(無題) 削除/引用 No.4443-9 - 2015/10/07 (水) 09:03:40 - おお ネオマイシン耐性遺伝子の発現でG418によるセレクションが出来ます。ただケミカルとしてのネオマイシンはよりバクテリアへの阻害活性が強く、実際医薬品として売られています。人などの細胞でどれくらいribosomeへ阻害活性があるか詳しく調べてませんが、バクテリアへの特異性がたかいとおもいます。カナマイシンもネオマイシン耐性遺伝子でrescueできますが、そもそもマンマルの細胞にはカナマイシンはききませんよね。 https://en.wikipedia.org/wiki/Neomycin Neomycin or kanamycin can be used for prokaryotes, but geneticin (G418) is, in general, needed for eukaryotes.

(無題) 削除/引用 No.4443-8 - 2015/10/07 (水) 07:51:03 - 横からです ネオマイシンとG４１８って違うんですか？ 私は293細胞にプラスミド導入してネオマイシンで選択してました。普通にできました。 G４１８は昔のラボで使っていました。 >[Re:3] おおさんは書きました : > RAW264.7はネオマイシン耐性遺伝子がないとおもいますが、transfectionしてセレクションしているんですかね。。。 > > また、セレクションにはネオマイシンよりもG418を使うのが一般的だと思います。 > > 浮遊細胞はあまりわかりませんが、G418を加えてから顕著なセレクションがかかりだすのは1週間後ぐらいです。加えてtransfectionの効率が悪ければしばらくは見た目には増えてないように見えるかもしれません。 >

(無題) 削除/引用 No.4443-7 - 2015/10/01 (木) 13:41:15 - おお だからネオマイシンいらないんじゃないの。

(無題) 削除/引用 No.4443-6 - 2015/10/01 (木) 12:18:39 - あ 細胞を頂いた日に細胞を播種してDMEMで培養して、増えた?ときに細胞をZENOAQ社のセルバンカー2に保存しました。 このときは時間がなかったのでその日のうちにストックを増やせなく、1ヶ月ほど液窒に保存して最近再び培養しました。 解凍・播種したその日は細胞は比較的安定しているように見えましたのでストック状態はたぶん大丈夫だと思うのですが、日に日に弱っていってるようです。

(無題) 削除/引用 No.4443-5 - 2015/10/01 (木) 11:12:10 - み ＲＡＷは接着系だったような気がしますが。 ATCCのdatasheetも接着系と記載されています。 http://www.atcc.org/products/all/TIB-71.aspx dishはtissue culture dishを使用されていますか？ そもそも提供された細胞のストック状態が悪く起こした時点で全滅していた可能性は？ もちろん起こし方が下手で全滅した可能性も否定できないが。

(無題) 削除/引用 No.4443-4 - 2015/10/01 (木) 10:59:24 - あ 回答していただきありがとうございます。 培地を変えてみたり、抗生物質を抜いてみたりして様子を見ているところですが、これといって変化がないので、細胞の提供先の先生に再度問い合わせてみます。

(無題) 削除/引用 No.4443-3 - 2015/09/27 (日) 23:52:03 - おお RAW264.7はネオマイシン耐性遺伝子がないとおもいますが、transfectionしてセレクションしているんですかね。。。 また、セレクションにはネオマイシンよりもG418を使うのが一般的だと思います。 浮遊細胞はあまりわかりませんが、G418を加えてから顕著なセレクションがかかりだすのは1週間後ぐらいです。加えてtransfectionの効率が悪ければしばらくは見た目には増えてないように見えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4443-2 - 2015/09/27 (日) 22:20:54 - mon 接着しない・増えが悪い原因には、浮遊細胞用Dishを間違えて使用している等の単純なミス、細胞密度が低すぎる（25%~50%コンフルエント以上を維持しないとほとんど増えない細胞もある）、培地に添加している血清のロットが合わないという理由が多いと思います。ただし最近の血清はメーカーが予め数種の細胞で試験しているものが多く（自分が使用している細胞では）ハズレが少なかった経験がありますので当てはまらないかも。 細胞をもらったところに培養条件を詳しく聞き、可能なら培養液（あるいは血清）を分与してもらって使用品と比較してはいかがでしょうか。 なお、ネオマイシンは細菌類に殺細胞効果（タンパク質合成阻害）を示す抗生物質です。ネオマイシン耐性遺伝子の産物は、培養細胞に殺細胞効果（タンパク質合成阻害）を示すG418（商品名：Geneticin）も不活性化します。すなわち、培養細胞で遺伝子導入細胞を選択するときには、ネオマイシン耐性遺伝子（由来によりI型、II型がある）とG418の組み合わせで用います。 従って「RAW264.7とJ774.1細胞にはネオマイシン耐性がない」は間違いです。ネオマイシンは（通常濃度なら）培養細胞には効果はありません。ただし希に抗生物質（その分解産物？）に感受性が高い細胞がありますので、抗生物質を抜いて培養してみてはいかがでしょうか（RAW264.7とJ774.1細胞がそれに該当する否かは知りません）。 また、「細胞培養液に使う抗生物質に.......を1%として使用しています。」という表現は誤解を招きます。1%=10g/L＝10mg/mLと取られかねません。あさんの記述の意味は、「市販の混合液を1/100量添加した」だと思いますが、有効濃度が不明なので（質問にお答えする上で）全く意味がありません。

RAW264.7・J774.1へのネオマイシン使用 削除/引用 No.4443-1 - 2015/09/27 (日) 18:43:45 - あ いつもお世話になっています。 ネオマイシンは一般的にトランスフェクションなどで細胞のセレクションを行うことを学んだのですが、通常の細胞はネオマイシン耐性は持っていないのでしょうか？ 前にいた研究室ではHEK293などトランスフェクション専用の細胞などを扱っており、セレクションなども行っていました。 現在は研究室を移り、RAW264.7やJ774.1細胞を扱い始める(最近共同研究先にもらった)ところです。 しかし、もらったこの二つのマクロファージ様細胞の増えが悪い上にほとんどの細胞が接着しません。かれこれ3週間と4日培養していますが、一向にコンフルになりません。 うちの研究室では細胞培養液に使う抗生物質にペニシリン、ストレプトマイシン、そしてネオマイシンの混合液を1%として使用しています。 本題に戻ると、RAW264.7とJ774.1細胞にはネオマイシン耐性がないためにこのような事態が生じているのでしょうか？ でも、完全に死んでいるわけではないので、耐性がないからという理由も少し考えにくいです。 ご教授頂けないでしょうか？

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