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(無題) 削除/引用 No.4440-7 - 2015/09/26 (土) 08:40:55 - L ヒトではなくマウスの細胞ですが、EEA1やLAMP1の免染をやってます。固定はPFAで、透過した後は、detergentなし（5%BSA/PBSでブロック及び抗体染色、洗浄はPBS）でやってますが、染色の再現性は取れてます。固定時間はあまり厳密に決めてない（室温で10分から20分程度）ですが、固定時間によって染色への影響が出る感じはないです。 メタノール固定の場合は数分の差で影響が出るかもしれません。メタノールを使っている同僚が言うには、短め（5分）の固定の方が良いとの事です（自分で試した訳ではなく、無責任モードですいません）。検体数が多い場合、固定時間をそろえるのも大変だと思いますので、PFA固定を一回試してみてもいいような気がします。 私たちも、Rabの免染を始める予定なのですが、Rabの場合はPFAよりメタノール固定の方が良いのでしょうか？ 便乗で申し訳ないのですが、ご意見お伺いできませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4440-6 - 2015/09/25 (金) 15:21:21 - おお どうしてもバックがというなら、抗体溶液は血清入りのデタージェントを含む溶液にして、washはdetergent無しというのもありかもしれません

(無題) 削除/引用 No.4440-5 - 2015/09/25 (金) 15:16:22 - おお 有機溶媒でこていされていますので、PFAなどと違ってクロスリンクで蛋白が架橋されたりしませんので、一部の蛋白は溶け出る可能性が高いと思います。界面活性剤はいわば洗剤で汚れを落とす能力がありますから。

(無題) 削除/引用 No.4440-4 - 2015/09/25 (金) 14:55:59 - 横 4% PFAでの固定は試されましたか？

(無題) 削除/引用 No.4440-3 - 2015/09/25 (金) 14:54:31 - IF おお様、コメント有難う御座います。 固定後のブロック溶液として、5% BSA in PBS-T (0.1 % トリトンX100)を用いていまして、抗体希釈液も同様です。洗浄にはPBS-T (0.1% トリトンX100)を用いています。 抗体希釈溶液中の界面活性剤には非特異的な吸着を防ぐ意味合いもあると思います。 そのような中で界面活性剤を抜くことでどういったことが考えられるのでしょうか？ 界面活性剤入りいではvesiclesなどが溶けてしまうことを危惧してでしょうか？ IFは本当にはじめてなもので、まだ自分の手技というか結果を自信を持って信用はできない段階にいます・・

(無題) 削除/引用 No.4440-2 - 2015/09/25 (金) 14:48:11 - おお 染色の操作でtritonとかtweenとかdigitoninとか界面活性剤使っているのなら、抜いてみるといいかもしれません。

エンドソームライソソームの免染結果がブレる原因 削除/引用 No.4440-1 - 2015/09/25 (金) 14:14:59 - IF 今、ヒトの培養ガン細胞株のエンドゾームやライソゾームを染めていますが、染まったり染まらなかったりとブレが酷いです。 原因として、多検体を処理しているために始めの細胞と最後の細胞とでは時間差が生じてしまいます。 例えば最初の冷メタノールで10分固定では1分以上、3分未満の誤差が最初と最後で生じています。 これまで24-well plateにガラスの円形プレートを入れてジェラチンでコートしたのちに細胞をまいていました。先ほど4-well plateという変わったプレートを見つけたので、以後これで少検体にわけて染めようとは思っています。 ただ、fixationだけが原因かと考えると自信がありません。 みなさま Rab5やLamp1は冷メタノールで10分で固定していますか？ 10分は長すぎでしょうか？論文を探すと中には2-3分の固定というのもみかけます。 PFAでもいいのかもしれませんが、サンタクルズ社が冷メタノールを推奨していました。 DAPIも場合によっては染まりが悪かったりしています。もちろん遮光はしていますし、上手くいった翌日に再現性を取ろうとして再度染めても染まらなかったりするので試薬の劣化とは考え難いです。Rab5やLamp1の他に、Calnexinは綺麗に小胞体が染まるのを確認しています。 冷メタノール固定でトリックや時間などオススメや注意点がありましたら教えていただけませんでしょうか？ 大変稚拙な質問で申し訳ありませんが宜しくお願いします。

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