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(無題) 削除/引用 No.4434-11 - 2015/10/15 (木) 07:03:05 - Teratomas ttm様、 お返事が大変遅れてしまいすみません。 ご教示いただいた23Gを用いて麻酔下で本日インジェクションを行いました。 テラトーマが無事形成されることを願っています。 IACUCのプロトコルでは腫瘍形が2cm^3の時点で安楽死させるように申請しました。 マトリゲルは今回は使いませんでした。10^6の細胞を100マイクロリットルでインジェクトしたので、かなり濃縮されていますので、分散されないことを祈っています。 経験に基づくご意見をいただきまして、この度は本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4434-10 - 2015/10/15 (木) 06:58:45 - Teratomas おお様、 本日背中の皮下に移入することができました。 針はttm様にご教示いただいたように23Gで行いました。 動物実験をそれほど頻繁に行うようなラボでもないので、大きめのニードルをオーダーするのがはばかられました。隣りの研究室で借りるのは情けないからやめなさいというボスの狭間におりました。

(無題) 削除/引用 No.4434-9 - 2015/10/09 (金) 07:40:11 - ttm 23Gで背中に皮下注、もしくは後肢ももあたりに筋注でテラトーマを形成しました。 背中の方が簡単な印象です。 針は太い分には問題ないと思います。免疫不全マウスなので基本それなりの設備の施設で飼育していると思いますし、注射だけなので毛は特に剃っていません。 慣れていればそのまま注射してもよいですが、不慣れであれば麻酔も考えた方がよいと思います。 いずれにしても、施設の動物実験の申請が通っていれば手法については問題ないはずですが、移植の方法や腫瘍が大きくなった際のエンドポイントを示す必要はあります。 前の方が示しているプロトコールにも記載していますが、マトリゲルをもっているなら使用した方が移植時に細胞が分散しないので効率よくテラトーマを形成しやすいようです。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.4434-8 - 2015/10/09 (金) 04:51:54 - おお 海外でも送ってくれそうな気がしますけどね。。。背中って皮下ですか? たとえば通常の腫瘍細胞ならサイズなどの確認もあるので剃ることはまあまああると思います。 しかし研究室にないからそれにあわせて実験するのですか? オーダー通せなくてどうするよみたいな。すぐいるならどこかの研究室が持ってるでしょうに、さがして借りてくればいいのに。

(無題) 削除/引用 No.4434-7 - 2015/10/09 (金) 04:02:14 - Teratomas Teratoma形成アッセイにつき、引き続きコメントをいただけますと幸いです。 hiPSCsは順調に育っています。 NSGマウスのdorsal flankに1x10^6 cells/100 ulをインジェクトする予定でいます。 この際のシリンジの口径はiPS研究所のプロトコルでは25-26Gとなっていました。 残念ながら私の研究室には21、23、28G（28Gはインスリンシリンジ）しかありませんでした。 ある程度のクランプを形成させたままインジェクトするので、23Gでは十分すぎるほどの口径だと思いますが、大き過ぎでもいけないでしょうか？例えば漏れ出てくるなどが実際あり得ますでしょうか？ iPS研究所のプロトコルではインジェクト部位として腎臓の被膜内に投与するとありました。 私は論文検索の結果から最もよく使われている背中にインジェクトすることにしていますが、この際には体毛は剃るべきでしょうか？ 大変稚拙な質問で恐縮ですが、再度ご教授をいただけますと幸いに存じます。 どうぞ、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4434-6 - 2015/09/22 (火) 15:30:24 - Teratomas 三胚葉様 引き続きコメントをいただき本当にありがとうございます。とても心強いです。 また何度も何度も質問してしまいすみませんでした。 > 　　１）「ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール(第2版　2010年）」です。 > 　　　理研のサイトによると、製本を郵送してくれるそうです。 現在海外留学中なので、郵送となると難しそうですね・・ > 　　2)Current Protocol in Stem Cell Biology 4A.2.18 > に載っています。 二つ目は下記リンクからダウンロードできました！！ ttp://sky.scnu.edu.cn/jpkc/xbswx/ckwx/Generation%20and%20Characterization%20of%20Human%20Induced%20Pluripotent%20Stem%20Cells.pdf 本当にありがとうございます！しっかり読んで実験に備えたいと思います。まずは研究施設での倫理委員会でprotocolが承認されるようにきちんと手続きを踏みたいと思います。 実はiPSCsのmaintenanceはテクニシャンの方が行っており、彼は週末（土日）はこないのでその間はfeedingしていないことになります。私がすれば良かったですね・・問題点がひとつ見つかったということで、次回から気をつけたいと思います。 何から何までご教示いただきありがとうございました。 手探りで進めていましたので、早い段階で失敗に気づくことができたと前向きに考えます。 この度はありがとうございました。 また、細胞は氷上で扱うとのこと、了解いたしました。 ありがとうございました。

Re<hiPSCsでのテラトーマ形成アッセイ 削除/引用 No.4434-5 - 2015/09/22 (火) 15:01:46 - 三胚葉 正確な情報でなくてすみませんでした。 CiRAが出しているprotocol (pdf)を読みましたが、teratomaの実験に関しての詳細な記述はありませんでした。 　　　 　　　確認しましたが、確かにありませんね。私の思い違いでした。 Teratoma formation assayに推奨されている公開されているprotocolというものがあるのでしょうか 　　１）私は理化学研究所で行われたヒト多能性幹細胞培養実習に参加して 　　　いろいろと教えて頂きました。その時のプロトコールがバージョンアッ　　　プされて理研から配布されています。昨年までネットでPDFを落とせた　　　のですが今はできないようです。 　　　「ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール(第2版　2010年）」です。 　　　理研のサイトによると、製本を郵送してくれるそうです。 　　2)Current Protocol in Stem Cell Biology 4A.2.18 に載っています。 自作したiPSCsの培養も正直うまくいっているわけではありません。今朝はほとんどすべての細胞が分化してしまっていました。練習あるのみでしょうか・・ 　　　分化しやすいとのことですが、私は毎日培地交換をすることによって改　　　善しました。今では、3日まで効果が持続するｂFGFがありますし、、、 　　　頑張ってください。 　　　P.S. 細胞はもちろんon iceで動物室まで運んでください。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.4434-4 - 2015/09/22 (火) 13:57:47 - Teratomas 三胚葉様 経験をお持ちのかたから大変貴重なコメントをいただくことができてとても嬉しいです。ありがとうございます。 横様がお示しになられた論文にもY-27632は必要はないと書かれていました。三胚葉様もそのようにされているとのことで私もそれに倣うことにいたします。ありがとうございます。 消化酵素は通常のもので良いのですね。そしてバラバラにする必要もないとのこと、とても参考になります。いつものpassage同様、ReLeSRで細胞を剥がすことにいたします。 > 細胞浮遊液には幹細胞用培地を使いました。血清や抗生剤は入れませんでした。 そうなのですね。とても参考になります！！では通常のpassage同様に、mTeSR1で細胞を調整しようと思います。30分以内の投与も意識することにします。 本当にありがとうございました。 私は、CiRAが出しているprotocol (pdf)を読みましたが、teratomaの実験に関しての詳細な記述はありませんでした。 ttp://www.cira.kyoto-u.ac.jp/e/research/images/protocol/pdf/hipsprotocolv2_090304.pdf#search='generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells' これ以外にも、Teratoma formation assayに推奨されている公開されているprotocolというものがあるのでしょうか？google scholarで検索するといくつものteartome用のprotocolが出てきて、どれを参考にすべきか困っていました。もしRIKENやCiRAが出しているprotocolで私が見過ごしているものがありましたら、どうかご教示いただけないでしょうか？ 自作したiPSCsの培養も正直うまくいっているわけではありません。今朝はほとんどすべての細胞が分化してしまっていました。練習あるのみでしょうか・・ > 理研やCiRaから出ている講習用テキストを読んでいないのでしたら、一度　　目を通されるといいですよ。詳しく解説してあります。

Re;hiPSCsでのテラトーマ形成アッセイ 削除/引用 No.4434-3 - 2015/09/22 (火) 10:06:27 - 三胚葉 何回か実際に投与経験のあるものです。 1. マウスに移入するためにhiPSCsの懸濁液を調整する必要がありますが、その際には通常のpassage同様にROCK阻害剤 (Y-27632)入りのPBSもしくはDMEM/F12に懸濁したものを移入するべきでしょうか？ 　　Y-27632は入れませんでした。入れても問題はないと思いますが、 　　わざわざ入れる必要はないと思います。 2. 先行論文によると、iPSCsはコラゲナーゼIVで消化して、それを移入するとありました。これを通常のpassage同様にReLeSRでiPSCsをdishから剥がし、コラゲナーゼIVの代わりとして調整してもいいのでしょうか？ 　　酵素消化は通常使っているものでよいと思いますが、細胞を 　　完全にバラバラにする必要はなく、小コロニー状態で良いと 　　教えられました。 3. 移入する際の懸濁液として、PBSやDMEM/F12などを用いている論文をみました。この時、血清や抗生物質は不必要という理解でいいでしょうか？ 　　細胞浮遊液には幹細胞用培地を使いました。細胞はなるべく生きのいい 　　状態でということで、採取後30分以内に投与しました。血清や抗生剤は 　　入れませんでした。 　　理研やCiRaから出ている講習用テキストを読んでいないのでしたら、一度　　目を通されるといいですよ。詳しく解説してあります。

(無題) 削除/引用 No.4434-2 - 2015/09/21 (月) 00:57:18 - 横 http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0045532

hiPSCsでのテラトーマ形成アッセイ 削除/引用 No.4434-1 - 2015/09/20 (日) 16:10:07 - Teratomas この度は大変お世話になります。どうぞ宜しくお願い致します。 ある遺伝子をノックアウトすると外胚葉系への分化が障害される可能性がin vitroのデータで得られました。そこで、hiPSCsをNSGマウスに移入し、テラトーマを形成させ、ni vivoでそのデータを検証できればと計画しています。 hiPSCsはMatrigel上にてmTeSR1で培養しています。 ３点質問させていただけないでしょうか？ 1. マウスに移入するためにhiPSCsの懸濁液を調整する必要がありますが、その際には通常のpassage同様にROCK阻害剤 (Y-27632)入りのPBSもしくはDMEM/F12に懸濁したものを移入するべきでしょうか？ 2. 先行論文によると、iPSCsはコラゲナーゼIVで消化して、それを移入するとありました。これを通常のpassage同様にReLeSRでiPSCsをdishから剥がし、コラゲナーゼIVの代わりとして調整してもいいのでしょうか？ 3. 移入する際の懸濁液として、PBSやDMEM/F12などを用いている論文をみました。この時、血清や抗生物質は不必要という理解でいいでしょうか？ 約25報ほどの論文を参考にし、NSGやSCIDマウスのdorsal flank (皮下注)に1x10E6個のhiPSCsを移入しようとしています。論文では確認できなかった上記3点につき、ご意見ご感想等をお聞かせいただけますと幸甚です。 テラトーマ形成アッセイは初めてです。どうか、ご教示をよろしくお願いいたします。

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