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(無題) 削除/引用 No.4433-8 - 2015/09/21 (月) 12:22:55 - toto 同じような事を考えて、長いベクターの機能ユニット部分だけをPCRで切り出してtransfectionしてみたことがありましたが、全然だめでした。長いベクターだから入りにくく、短い方が入りやすいのは確かだし、昔はstableつくるのに制限酵素で切って入れたりもしてたので、謎で終わりましたが。もしかするとメチル化されてないからエンドソーム内で分解されたのかもしれません。 長いプラスミドが入りにくいのは、おそらくsupercoilの長さが数マイクロメーターになって、通常のエンドソームを形成しにくくなるからかと思いますが、必要なユニットだけの直鎖状DNAにしても、結構な長さになるはずで、エンドソームの作りにくさはたいして変わらないか、むしろ長くなるくらいかもしれません。ただ、これが本当に原因ならば、短い機能単位だけを混ぜてTFしてやれば効率は上がるはずですよね。

(無題) 削除/引用 No.4433-6 - 2015/09/20 (日) 22:55:03 - み 他の細胞では発現確認できているのだから単に繊維芽細胞への導入効率が悪いだけでしょう。 線状化やﾌﾟﾛﾓｰﾀｰをいじったところで微妙な改善しか望めない気がする。 ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞなら導入方法を変えるべき。 レンチが使える環境のようだしウイルス濃縮してﾎﾟﾘﾌﾞﾚﾝや類似試薬で感染効率あげればいけるのでは？

(無題) 削除/引用 No.4433-5 - 2015/09/20 (日) 11:42:45 - MP 繊維芽細胞ということですが、MEFでしょうか？確かにMEFだと293Tなどに比べると圧倒的に効率は落ちます。LP2000でもOKとは思いますが、経験上Fugene6が最も効率が良かったです。takaraのXfectが良いとの情報もありますが、少なくとも私のMEFでは全くだめでした。 あと確かにプロモーターは変えるべきです。EFあたりが強力と思います。 それとレンチですが、確かに4kbだとタイターは落ちますが、濃縮すればいけるはず。一般的にfibroは感染効率がいいですし、もし薬剤マーカーがのっているのであれば、効率は低くても選択すればいいわけですし。

(無題) 削除/引用 No.4433-4 - 2015/09/20 (日) 07:20:43 - おお ttps://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/guidelines-for-plasmid-dna-transfection.html

(無題) 削除/引用 No.4433-3 - 2015/09/20 (日) 04:23:26 - おお pEGFP-N1で15％だと、EGFPは非常に安定ですし、プラスミドが入った細胞がそれくらいだろうとはいえますが、実際発現させたい蛋白はそこまで発現していないだろうなとなんとなく思えます。

(無題) 削除/引用 No.4433-2 - 2015/09/20 (日) 04:20:24 - おお できますがそれで発現が劇的に改善されるとは言えるかどうか、、、あまり期待できなそうですがやってみられてもいいかと思いますけど、、、 CAGプロモーターなどにのせかえるとかの方がいいんじゃないかなぁ。あとは頑張って工夫してtransfectionの効率を上げるか。各社の試薬でサンプルがもらえるものからでも試してみるといいんじゃないかと。 lipofectamine 2000よりLipofectamine LTXの方が毒性がひくく、多めにDNAを加えられてたり入れっぱなしとか長期間transfectionが可能とかいろいろあるし。fugene 6とかHDなんかもそれなりに定評がありますし。

pcDNA3.1+を線状化して遺伝子導入 削除/引用 No.4433-1 - 2015/09/20 (日) 03:06:52 - なんち お世話になります。 上記プラスミドにインサートを挿入し、繊維芽細胞に遺伝子導入すると全く発現が確認されません。 C末にはタグが付いており、抗タグ抗体にて検出を試みています。 インサート長は4キロベースで、レンチ用プラスミドに載せ変えてウイルスを作ろうとしても非常に低いタイターのものしか採れてきません。どうにか上記プラスミドでレギュラーなトランスフェクションを行いたいので、質問させていただきました。 構築したプラスミドは293T、A549、CHO、HepG2などではきちんと発現してくれます。 そこでお尋ねしたいのは、インサートの発現に必要なユニットのみを制限酵素で調製し、ゲルから切り出した物を遺伝子導入できないかお尋ねしたいです。 みなさまそのようなご経験ありますでしょうか？ pcDNA3.1からAmpRやNeoRだけでも除けると随分と小さくなりますし、、 繊維芽細胞へはpEGFP-N1の導入も平行しておこなっており、それですと低めですが15％ほどの導入が確認されます。トランスフェクション後のバイアビリティは良好です。導入試薬はlipofectamine2000です。ご意見聞かせてください。よろしくお願い致します。

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