お世話になります。
つい先日からCRISPRを使った遺伝子ノックアウトに挑戦しています。
ターゲットにする遺伝子は一つで、それに対するCRISPRプラスミドは二種類購入しました。
トランスフェクトされた細胞ではOFP（オレンジ色）が共発現するようになるので、OFPでシングルソートしてクローニングしてジェノタイピングしています。
血管内皮腫の細胞株では目的とするKO細胞が取れました。
ただ、293Tで同じようにKO細胞を作ろうとするとヘテロすら取れてきません。
もう50クローンほどsequencingしています。ちなみに、OFPでbulk sortした細胞からsequencingするときちんと標的部位には変異は入っているようです。
以前のbiotechnical forumにて、《細胞増殖が盛んなほど、DNA修復されるのでKO効率は悪くなる》との書き込みが散見されました。
細胞分裂時にはゲノムの変異の有無のチェック等が入り、細胞分裂と修復がカップリングしているのかなとは想像しますが、実際293TでのKO細胞は作りにくいでしょうか？それとも私が購入したCRISPRプラスミドのデザインの問題なのでしょうか？
周りに聞ける方がいないので、ぜひご意見を聞かせていただけますと嬉しいです。 |
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