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(無題) 削除/引用 No.4411-9 - 2015/09/15 (火) 06:13:22 - manami いろいろとご親切にアドバイスありがとうございます。 NKはサイトカインでも刺激をしています。 でも、やはりCD3/CD28で刺激が得られた理由ははっきりしないですね。 もう一度再現されるか実験してみます。

(無題) 削除/引用 No.4411-8 - 2015/09/14 (月) 16:59:36 - po そう言うことでしたか。 プロテインキナーゼCの活性化や細胞内カルシウムイオン濃度の上昇はリンパ球が活性化する際にみられる現象です。PMA/ionomycin刺激では前者をPMAが、後者をionomycinが担います。そのあたりの詳しいことは教科書やネットに書いてあると思います。すみません。 私の経験で言えば、NK細胞の活性化はionomycinだけでも問題ありませんでした。また、NK細胞はT細胞などとは異なりIL-2、IL-7、あるいはIL-15単独でも活性化・増殖させることも可能です。

(無題) 削除/引用 No.4411-7 - 2015/09/14 (月) 12:09:47 - manami IFN-Gはintracellar stainingで評価しました。 いろいろなfactorで刺激した時の細胞活性のマーカー(マーカーとなりうると考えているもの)の発現を測定してます。実際の活性をIFN-Gなどでみています。 NK細胞だけでなくCD8+T細胞に関しても評価してるので、NK細胞に対してもCD3/CD28で刺激をしてみました。 ちなみに、PMA/ionoでもNKは活性化するのですか？作用機序はどのようになっているんですか？

(無題) 削除/引用 No.4411-6 - 2015/09/12 (土) 08:15:28 - po すみません、ビーズでしたか。 ハーセプチンでNK細胞を増やしていたことがあったので、それと同じ原理だと思っていました。CD28がNK細胞上に発現しているとの報告がありますが (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782433/)、NK細胞の機能への影響はあまりなかったみたいです。質問返しで申し訳ありませんが、質問者様はなぜNK細胞に発現していないCD3や影響の少ないCD28を標的にしたのでしょうか。活性化するだけなら、PMA/Ionoやアジュバントなどで十分だと思ったので。

(無題) 削除/引用 No.4411-5 - 2015/09/12 (土) 05:29:15 - protein IFNgammaはIntracellular stainingで見たんですか？NKから出てるんだとしたら不思議ですね。 ちなみにどのような現象を見ようとしているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4411-4 - 2015/09/11 (金) 21:28:57 - manami proteinさん、poさんアドバイスありがとうございます。 少し説明が足りないところがあったので、追加させてもらいます。 ＞magnetだけだとpurityは良くて95%、ものによっては60％ということもありえますので、残ったT cellが反応しているだけなのではと思います。 →purityは90％くらいありました。刺激後FACSでCD3-CD56＋でgate行い、それらの活性化マーカーが上昇していました。少し含まれるT cellが活性化しIFN-Gなどを分泌、それがNK細胞を活性化していると考えて良いのでしょうか？ ＞恐らくですが、CD3とCD28のFc領域をNK細胞が認識してるからではないでしょうか。つまり抗体依存性細胞傷害 (ADCC) によってNK細胞が活性化していると私は思います。 →CD3/CD28beadsを使用したので、Fc領域はbeadsに結合しているのでないでしょうか（違っていたらごめんなさい）？そうであれば、ADCCはあまり起きないと考えますがいかがでしょうか？ いろいろ質問ばかりしてすいません。ご教授お願いします。

(無題) 削除/引用 No.4411-3 - 2015/09/11 (金) 07:43:55 - po 恐らくですが、CD3とCD28のFc領域をNK細胞が認識してるからではないでしょうか。 つまり抗体依存性細胞傷害 (ADCC) によってNK細胞が活性化していると私は思います。なので、CD3/CD28 に限らずFc領域を持つ抗体であればin vitroで活性化させることは可能です。NKT細胞はCD3陽性ですが、PBMC中の頻度は低いのであまり関係ないように感じます。 通常はCD3+/CD56-がNK、ダブルポジティブがNKT細胞なので、サイトカインなどがどちらの細胞から産生されているかはFACS解析で分かります。

purity 削除/引用 No.4411-2 - 2015/09/11 (金) 01:56:55 - protein まずはsortingのpurityを見てみるのがいいのでは？magnetだけだとpurityは良くて95%、ものによっては60％ということもありえますので、残ったT cellが反応しているだけなのではと思います。

NK細胞に対するCD3/CD28刺激について 削除/引用 No.4411-1 - 2015/09/10 (木) 23:00:59 - manami いつもいろいろ参考にさせていただいています。 NK細胞に関して質問があります。 ヒトPBMCよりmagnetでsortingしたCD56+細胞を、CD3/CD28beadsで刺激したところ細胞が活性マーカー（CD69）が上昇しサイトカイン（IFN-G）産生も上昇しました。理由を調べてみましたが、よくわかりません。 NKT細胞が含まれているからでしょうか？NK細胞自体がCD3/CD28刺激で活性化するのでしょうか？いろいろ論文を読んでいると、NK細胞をPMA/Ionomycinで刺激しているものも見かけます。 周りに相談できる相手がいないので、どなたかアドバイスいただければ幸いです。

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