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(無題) 削除/引用 No.4409-7 - 2015/09/10 (木) 16:58:23 - はやし >>おおさん 貴重なアドバイス有難うございます。 以前やっていた方のデータがなく、どのくらい希釈したらいいのか分からないため、リコンビナントのTNF-αを注文してからサンプルの希釈を行いたいと思います。 >>まっくろんさん そうですね みなさまのおっしゃられている通りサンプルが濃いのが原因ですね。。。 LPS濃度のや細胞濃度の組合せの検討などもやってはいたものの、やはりサンプル濃度が濃く差が出なかったですね。 またサンプルの希釈のいいところを見つけた後でそちらも検討したいと思います。 有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.4409-6 - 2015/09/10 (木) 12:07:48 - まっくろん 　みなさんがおっしゃるようにサンプルが濃いのだと思います。サンプルが残っていれば，1/10毎に薄めていけば，ELISAがしっかりワークしていれば見ることが出来ると思います。 　また（すでに計画に入っているかもしれませんが）阻害作用を見るとのことなので，時間が許せば細胞数，LPS濃度，クルクミン（クルクミンはそんなに振らなくてもいいかもしれませんが）をそれぞれ数段階に振って，きれいに阻害効果が観察できる条件を見つけてはどうかと思います（細胞株なので予備実験であれば2〜3wellくらいで）。とても強力な阻害効果を持つものを評価するのであれば別ですが，数%〜数十%程度産生を抑制するようなものであれば，TNF産生があまりに高い条件だと，阻害効果がきれいに現れない可能性があるかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.4409-5 - 2015/09/09 (水) 23:36:06 - おお 昔図ったサンプルで濃度が測定されているものがあればそれをスタンダードトとしてとりあえず、その濃度以下のサンプルは測定可能だと思いますけど。希釈すればその濃度以下にになるのでたいていは測定可能かもしれません。 また発色が強いのはたぶん濃度がその検出システムにたいして濃い可能性が高いですね。

(無題) 削除/引用 No.4409-4 - 2015/09/09 (水) 19:22:39 - はやし >>alphaさん そうですね。 LPS添加してからの時間は論文など見てはいたものの検討していませんでした。 24時間ではなく、もうすこし短くして検討行ってみます。 有難うございます。 >>まさん すいません。 4.0×10^4　の間違いでした！！ そうですよね。 スタンダードがないので上清中のTNF-αの量がどの程度のものなのかとか分からないですよね 購入を考えてみます！！ ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4409-3 - 2015/09/09 (水) 19:13:48 - ま >4.0×10^5　cells/well 濃すぎません？1/10 (4×10^4 cells/well)でも24h後だとほぼコンフルぐらいな気がします。/mlのミス？ 一瞬で発色するとのことなら、とりあえずはサンプルの希釈（100倍とかもっと）でやってみるのも手だとは思いますが、実験を何回もやるよりはスタンダードにリコンビナントとか買った方が安くつく気がします。

(無題) 削除/引用 No.4409-2 - 2015/09/09 (水) 18:50:50 - alpha LPSによるマクロファージへの分化制御をTNFの産生量を指標に評価しているということでよろしいでしょうか？ 何点か気になりますが、LPSの刺激時間は最適でしょうか？ LPSへの応答性は非常に高いので、短時間でもTNFはでると思います。 はやしさんが目指す実験系に近い論文と同条件で検討されるべきかと思います。 このような実験系は探せばいくらでもあるでしょう。

マクロファージのTNF-α産生抑制について 削除/引用 No.4409-1 - 2015/09/09 (水) 18:10:13 - はやし お願いします。 現在、RAW264.7細胞を用いてLPS誘導性のTNF-α産生量をELISAで測定しています。 研究室立ち上げ1年目なのでプロトコールは前先生がいた大学の時のものを使用しているのですが、全く同じ方法なのに私が行った場合、一瞬で発色してしまいサンプルごとの阻害率をみるどころの騒ぎではなくなってしまいます。 論文と前同じ実験を行っていた人のプロトコールを参考にして、細胞を96well　プレートに4.0×10^5　cells/wellで播いて、24時間培養しサンプルを添加し、30分後にLPSを終濃度50ng/mlになるように添加し24時間後に測定しています。 ELISAにはMouse TNFα ELISA Ready-SET-Go!というキットを用いています。 LPS添加していないwellは他のwellと比較して発色は弱いです。 阻害を見たいのでポジコンにクルクミンを使用しているのですが添加してもなんら変化が有りません。 細胞株やFBSは前されていた方の時と同じものを使用しています。 LPS濃度や細胞数など検討し、細胞も新しく起こしたり、新しい株を貰ってきて行ったりしたのですがうまくいきません。 スタンダードが使い切られてしまっていたため検出範囲を超えてしまっているかも分からない状況です。 スタンダードを用いて行わなければならないのは分かっているのですが、お金の問題などありなかなか難しいです。 個人的にはもう細胞上清を希釈して測定するしかないのかな、と思っています。 他に検討すべき点やアドバイス等あればお願いします。

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