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ご回答ありがうございます 削除/引用 No.4408-9 - 2015/09/11 (金) 08:28:41 - nobu 皆様方 　この場をおかりして、早急なご回答ありがとうございます。 　現在、色々と試行錯誤しながら抽出を行っているところでございます。 　皆様よりいただいた意見を参考に研究進められたと思います。

(無題) 削除/引用 No.4408-8 - 2015/09/10 (木) 17:15:34 - AP AMPureXP使用をデフォにしているのはロシュのNGSシステム（GS) もそうです。

ヒト細胞の選択的溶解法 削除/引用 No.4408-7 - 2015/09/10 (木) 16:50:14 - 名無し イルミナはAMPureXPを一押ししている印象がありますよね、他製品よりもメリットがあるということなのでしょうか。回収率や精製度で有利であればスレ主さんもAMPureを使うと良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.4408-6 - 2015/09/10 (木) 11:47:07 - seventh 夾雑物の疑いがある場合はAMpureをサンプルに対して0.8倍量加えるプロトコルで精製するようにイルミナから言われたことが有ります。 原因はオリゴヌクレオチド、タンパク質、多糖などいろいろあるみたいですが

(無題) 削除/引用 No.4408-5 - 2015/09/09 (水) 23:16:08 - おお サンプルにUV領域に吸収をもつものが混じっているのでしょう。余裕があるならもう一段階なにか精製するとましになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4408-4 - 2015/09/09 (水) 17:55:31 - 橘 理論的にどうかは知りませんが、多くの場合Qubitの方が正確です。 Nanodropの値に基づいて濃度調整した場合とQubitの値に基づいて濃度調整した場合では、multiplexしてNGS解読した場合にQubitの方がサンプル間のリード数のバラつきがずっと小さくなります。 特に夾雑物が多くて低濃度の場合、Nanodropでは本来よりすごく高い濃度になっているようです。 うちではNanodropがQubitの100倍以上の濃度を示したことも何度もありました。 10倍程度なら何ら不思議なことはないように思います。 気になるのであれば、NGSライブラリ調製後にqPCRで厳密に濃度調整してはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4408-3 - 2015/09/09 (水) 17:34:59 - AP 吸光性をもつ物質が夾雑しているんでしょうな。 DNA特異的な色素の蛍光強度で測定した値のほうが信用できるでしょう。 サンプルが下水だとなると、何が入っているかわかりませんもの。 シリカ法では完全には取り除けないでUVを強く吸収する物質があるのかもしれません。ちなみに、過去トピにはシリカでRNAを精製する系では、しばしばグアニジンITCが完全に取り除けていないことがあって、OD230を押し上げるという話がありました。

(無題) 削除/引用 No.4408-2 - 2015/09/09 (水) 17:29:35 - ま 一般論として。 ・Nanodropの定量値 あくまで吸光度です。260nmに吸光を持つほかの物も含んだ値となります。 RNAなどが代表例ですが、A260/280:3.38というのはそれ以外も含んだ値に思われます。 ・Qubitについて Nanodropよりは正確な値が出ますが、界面活性剤など、成分によっては蛍光が阻害・増強され、正確でない値を示すことはあります。マニュアルに阻害の原因となる成分の例が乗っていると思います。 また、Qubitが正しいとするとお示しの濃度ですとNanodropで定量するにはあまりに低濃度ではないかという気がします。

DNA（dsDNA)のQubitでの定量値 削除/引用 No.4408-1 - 2015/09/09 (水) 17:17:54 - nobu 現在、下水から、Q社の抽出kit（スピンカラムでの抽出）ならびにS社の抽出kit(ビーズチューブ使用しての抽出）を使用してDNAの抽出を行っております。 抽出したDNAは、NGS用に用いるため、NanodropおよびQubitを使用して精製純度および濃度を定量しております。 抽出後の濃度を見ると下記のようになりました。 Q社の抽出kit使用時 　DNA濃度(ng/μL) :Nanodrop定量値：79.97 (A260/280:3.38) 　dsDNA濃度(ng/μL)：Qubit定量値　 ：2.46 S社の抽出kit使用時 　DNA濃度(ng/μL) :Nanodrop定量値：25.22 (A260/280:1.88) 　dsDNA濃度(ng/μL)：Qubit定量値　 ：1.42 NanodropとQubitの定量値が1/10以上異なるのことは、理論的にありえるのでしょうか？　 NGS用にライブラリー調整時には、Qubit等でdsDNA濃度を正確に定量したサンプルを使用するのが一般的ですが、上記のような状態で中々後段の処理に行かない状況で困っております。 どなかた知恵をお貸しいただければ幸いと思いまして、投稿させていただきました。宜しくお願いいたします。

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