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(無題) 削除/引用 No.4399-6 - 2015/09/10 (木) 12:41:29 - 免疫細胞染色 グラ様、返信が大変遅れてしまい申し訳ありませんでした。 また、コメントをいただきまして、ありがとうございます。 ブロッキングには牛血清アルブミンを用いていました。 「二次抗体の宿主が違うということなら」というご指摘をいただき、今慌てて二次抗体ボックスを確認しましたところ、Donkey-anti-rabbit IgGとDonkey-anti-goat IgGの二種類の同一宿主（ドンキー）の二次抗体を見つけました。早速これで行ってみます！ヒントをいただきありがとうございました。 一次抗体の多くはサンタクルズ社より購入したもので、多くがヤギでした。 ドンキーを二次抗体の宿主としてそろえるというのはすごくよく出来たシステムで感動しました。ありがとうございました。 >[Re:5] グラさんは書きました : > 二次抗体の宿主が違うということなら、ブロッキングに何を用いたのか気になりますね。 > > 当方では、WBも含めて、二次抗体は全てヤギ抗体だけを使っています。

(無題) 削除/引用 No.4399-5 - 2015/09/06 (日) 08:52:08 - グラ 二次抗体の宿主が違うということなら、ブロッキングに何を用いたのか気になりますね。 当方では、WBも含めて、二次抗体は全てヤギ抗体だけを使っています。

(無題) 削除/引用 No.4399-4 - 2015/09/06 (日) 00:22:29 - 免疫細胞染色 おおさん、みさん、ご指摘頂きありがとうございます。 二次抗体の宿主について、気にも留めたことがありませんでした。 今確認しましたところ、 Donkey-Alexa488-anti-Goat IgG Goat-Cy3-anti-Rabbit IgG でした。 分泌タンパク質に対する抗体はヤギ由来のものですので、おそらく 1.　分泌タンパク質の染色パターンは真 2.　カルネキシンの染色パターンは小胞体および分泌タンパク質が局在する箇所 ということになりそうです。本当に恥ずかしい限りです。 ご指摘頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4399-3 - 2015/09/05 (土) 17:08:50 - み >[Re:1] 免疫細胞染色さんは書きました : > 一次抗体として、抗分泌タンパク質抗体（ヤギ）と抗Calnexin抗体（ラビット）をブロッキング溶液で希釈して、１時間室温で反応させました。各終濃度10 ug/mlです。 > > その後のことをお聞きしたいです。 > 二次抗体として、Alexa488-anti-Goat IgGとCy3-anti-Rabbit IgGを使用しました。 > Alexa488-anti-Goat IgGの宿主は何の動物ですか？ Rabbitじゃないですか？ そうだとするとCy3-anti-Rabbit IgGが認識しますよね。 おおさんが指摘するように抗分泌タンパク質抗体（ヤギ）とAlexa488-anti-Goat IgGのみで染色しても小胞体内で染まれば本当らしいですね。 しかし、２重染色での変なクロスリアクト（上記のような）は別問題。

(無題) 削除/引用 No.4399-2 - 2015/09/05 (土) 09:31:59 - おお http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3164 なんともいえませんが、抗体がワークしているかどうかを気にするなら単独で染めたりとかもしてみて、確認するところからじゃないですかね。 まあERで完全に一致するのはそう言う実験はほとんどしないですが、あまり驚きませんけど。

免染(ICC)での蛍光の重なりについて 削除/引用 No.4399-1 - 2015/09/05 (土) 08:49:58 - 免疫細胞染色 とても初歩的なことを質問させてください。 今、小胞体と分泌経路に乗る分泌タンパク質の細胞内局在を見ようとしている免疫染色初心者です。 ガラスに細胞をまき、その後、冷メタノール、10分で固定/膜透過化を行いました。 その後、1％ BSA in 0.1% Triton x100 in PBSで一時間ブロッキングを行いました。 一次抗体として、抗分泌タンパク質抗体（ヤギ）と抗Calnexin抗体（ラビット）をブロッキング溶液で希釈して、１時間室温で反応させました。各終濃度10 ug/mlです。 その後のことをお聞きしたいです。 二次抗体として、Alexa488-anti-Goat IgGとCy3-anti-Rabbit IgGを使用しました。 結果は、両者がアイソタイプコントロール抗体に比べて、しっかり染まり、両者は完全に一致しました。Calnexinの方は、核の周囲を染め、小胞体が染まっているように思います。もう一方は分泌経路に乗るタンパク質なので、小胞体、ゴルジ装置、などが染まってもいいように思います。ただこの抗体で免疫染色している論文はまだありませんので、私の結果が本当か不安があります。あまりにも共局在しており驚いているところです。 各二次抗体が、各一次抗体には交叉反応しないことは確認しました。 そうなると、顕微鏡の検出の方に問題（というより理解すべきところ）があるのではと思っています。例えばCy3の蛍光が、Alexa488の検出器（？）に漏れ込むようなことはあり得るのかと考えています。顕微鏡のどういったところを確認すれば、漏れ込みを見ているのか真の染色なのかを判断できるのでしょうか？機器はNikon Eclipse 80iです。 抗Calnexin抗体は、オルガネラマーカーとしてよく使われているので特異性には問題ないと思っています。 大変初歩的な疑問で申し訳ありませんが、よろしくお願い致します。

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