全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4393-15 - 2015/09/08 (火) 11:39:38 - lam 手持ちの本を見てみたら、H鎖とL鎖を分離するプロトコールがありました。 鎖間のS-S結合は切れるけど、鎖内S-S結合が切れない条件があるようです。 DTTで還元した後に、ヨード酢酸でアルキル化を行って再度結合するのを防ぐという手法でした。 精製はG-25のゲル濾過で行っています。 かなり古い本ですが、西村書店の免疫化学実験法に載っています。 図書館にあるかもしれませんね。 また、IgG, dithiothreitol, iodoacetic acidで調べるといくつか論文も見つかります。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.4393-14 - 2015/09/08 (火) 02:31:45 - おお 分泌しぐなるはあるとしても、安定性なども変わる可能性もあるしやってみないとわからないのではとおもったのです。

(無題) 削除/引用 No.4393-13 - 2015/09/07 (月) 15:28:30 - べーと >>おお様、lam様 ご回答ありがとうございます。 強制発現の系では、そのままで上手く行かなかった場合ご指摘の通り可溶性になるように手を加えるつもりでした。 > 抗体から還元した後に、徐々に戻せば安定な構造である分子内S-S結合が形成されると予想されます。 > いずれにしても、L鎖のみを精製する方法は必要ですね。 とありますが、この徐々に戻すという過程はどのような処理になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4393-12 - 2015/09/04 (金) 21:37:36 - lam >[Re:11] おおさんは書きました : > ちょっとよくわからないですがL鎖だけ強制発現させて分泌されるもんなんでしょうか。それともバクテリアなどの系のことを考えているのかな。。。 H鎖と一緒に分泌されるにしても、L鎖自体シグナル配列があるのでは？ 抗体から還元した後に、徐々に戻せば安定な構造である分子内S-S結合が形成されると予想されます。 いずれにしても、L鎖のみを精製する方法は必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.4393-11 - 2015/09/04 (金) 18:34:07 - おお ちょっとよくわからないですがL鎖だけ強制発現させて分泌されるもんなんでしょうか。それともバクテリアなどの系のことを考えているのかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4393-10 - 2015/09/04 (金) 18:23:04 - べーと >>lam様 それも考えたのですが、ご指摘のように時間がかかるかと思いまして… もし他の系でうまくいかなければ試したいと思います。ありがとうございます。 >>おお様 やはりそれがシンプルでいいかもしれませんね。 前述のように還元処理は経験がありませんので、手技については論文等をあさってみようと思います。 もし参考になるものがございましたらお教えいただければありがたいです。 どうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4393-9 - 2015/09/03 (木) 23:04:21 - おお まずはIgGを粗精製して(硫安沈殿とか)、得られたものをDTTとかの還元剤で処理して、少量のDTTなどの存在下でクロマトをすればいいと思うのだけど。クロマトはイオン交換でも疎水クロマトでもゲル濾過でもなんでもいいかと。

(無題) 削除/引用 No.4393-8 - 2015/09/03 (木) 20:02:01 - lam 少し時間がかかりますけど、ハイブリドーマを持っているならシークエンスを調べてL鎖だけ発現させるという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.4393-7 - 2015/09/03 (木) 19:57:24 - べーと >>よっしー様 そのことをすっかり忘れていました…ありがとうございます。 立体構造は可能ならば完全な状態で残したいです。（H鎖と解離してる時点でそうもいかないとは思いますが…） その点もふまえて、引き続きご教授よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4393-6 - 2015/09/03 (木) 19:19:40 - よっしー L鎖のIg様ドメインのS-S結合は切れてもいいのでしょうか？ もし良いのでしたら，カラムの許容範囲内で還元剤を入れておけば簡単に切れると思います．

(無題) 削除/引用 No.4393-5 - 2015/09/03 (木) 18:53:14 - べーと お三方、返信ありがとうございます。大変助かります。 AP様から頂いたご指摘に合わせて、情報を追加いたします。 ・抗体の生物種：マウス ・抗体種：モノクローナル ・スケール：あまり考えておりませんでした。ただ、後述いたしますがvitroでの使用を考えていますので、小スケールでも問題ないと思います。 ・目的：細胞と共培養し反応を観察する ・その他：回収はハイブリドーマの培養上清もしくはマウス腹水から行おうと考えています。 　　　　　κとλ両方について検討したいのでどちらも回収したいですが、これは株ごとに行えばよいので大丈夫だと思います。 >>よっしー様、 lam様 具体的なご提案ありがとうございます。 カラムとゲルによる精製は経験があるのですが、抗体の還元は行ったことがありません。 もし一般的な手法がありましたらご教授いただければ幸いです。 引き続きどうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4393-4 - 2015/09/03 (木) 18:42:37 - lam L鎖だけとってきて何に使うのだろう？ FabもしくはF(ab')2のことかな？ L鎖だけなら、還元した後にゲル濾過かL鎖特異的抗体をつけたアフィニティーカラムで精製できるのでは。

(無題) 削除/引用 No.4393-3 - 2015/09/03 (木) 18:32:17 - よっしー 元の試料が何か分かりませんが，proteinGで精製後，還元してゲルろ過，あるいは再度proteinGで精製でどうでしょう．

(無題) 削除/引用 No.4393-2 - 2015/09/03 (木) 18:17:56 - AP 抗体の生物種、抗体種（poly, mono)、精製スケール、可能なら目的、の情報があればアイデアわくかも。 例えば、軽鎖と言ってもκとλがあるけれど、両方共ほしいのか、どちらかだけでも良いけれどきれいなのがほしい、とかね。ヒトκ鎖だとprotein Lなんか使えるかも。

抗体のL鎖の単離法 削除/引用 No.4393-1 - 2015/09/03 (木) 17:36:17 - べーと お世話になっております。 表題の通りです。 抗体のL鎖のみを単離・精製したいのですが、簡便でローコストな方法はないでしょうか？ かなりざっくりした内容で申し訳ありません。全く経験がないものでして…ご容赦ください。 よろしくお願いします。

全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---