BioTechnicalフォーラム [NEED8の作用機序]

NEED8の作用機序

No.4391-TOPIC - 2015/09/02 (水) 10:59:11 - kuwman

いつもお世話になっております。

教科書的な質問になりますが、NEED8が標的プロテインに結合する際には、NEED8のN末やC末ではなく、NEED8の中のリジン残基などを介して標的プロテインに結合するのでしょうか？
膨大な情報の中を探っていたのですが、結局わからずで、混乱しています。

実験としては、あるプロテインがNEED8で標識されていると考えていて、２つの結合をウエスタンで確認しようとしています。NEED8の抗体は持っていないため、できればNEED8をMycタグ、標的プロテインはFLAGタグして、共発現したサンプルをウエスタンにて確認しようと考えています。

どなたか知っている方いらっしゃいましたらご教授よろしくお願いいたします。
　

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No.4391-7 - 2015/09/08 (火) 02:20:32 - おお

Hisでタグが入ってない場合は1%SDSでlysisして、ボイルで変性させてから1% TritonX-100, 0.1%Cholate をふくむTBSで10倍に希釈してからNEDDに対する抗体かNEDDにつけたmycなどのtagにつけた抗体でIPすればコバレントな結合を示すことができます。

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No.4391-6 - 2015/09/07 (月) 13:05:47 - kuwman

ご回答どうもありがとうございます。

>[Re:4] おおさんは書きました :
> そう言う実験はもうestablishされていて文献を見ればすぐわかるのではとおもいますが。
> ユビキチンなどでやっているアプローチも参考になると思います。

私の勉強不足でした。もう一度おおさんのおっしゃるように文献を調べてみたいと思います。

>[Re:5] JJI vs BBAさんは書きました :
> あんまりよくわかんないけど昔、人に聞いて遊び半分でやったときの記憶なんだが、N末にHis-tag付けた NEDDを発現.....

とても参考になる情報をありがとうございます。おおさんのコメント共に JJI vs BBAさんのアドバイスを参考にもう一度実験を計画したいと思います。どうもありがとうございました。

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No.4391-5 - 2015/09/04 (金) 22:48:29 - JJI vs BBA

あんまりよくわかんないけど昔、人に聞いて遊び半分でやったときの記憶なんだが、N末にHis-tag付けた NEDDを発現（一過性でも普通にできること多いけど、安定発現株の方がより良いかもしれない）させて6M塩酸グアニジンあるいは8M尿素などを含むbuffer（ただSDSは駄目な。グアニジンはSDSとすごい相性悪いので、溶出前の最後の洗いは尿素にしたほうがいい）を用いた変性条件下でニッケルカラム（あるいはビーズ）で精製して、精製物を電気泳動してそれからブロッティングして、予想する標的蛋白質に対する抗体でウェスタンで検出して、本来のその蛋白質の分子量よりも約10KDaあるいはそれ以上の分子量領域（nedd8はpolymerになってnedd8鎖になることができるのでそういうときは明瞭なバンドにならずゲルの上の方からのスメアなパタンになる）にシグナルでれば、Nedd8化されてるわ、これ、とか言ってた。実験としては簡単だからふつうに出来る。つまり、要はUbやSUMOのときの定番のpull-down assayと同じ。変性条件で精製しないとnon-covalentにくっついてるいろんな蛋白質が共精製されてきて、間違えのもとになるのでここは重要かも。変性条件でも精製に使えるtagというとHis-tagということになるのだともう、FlagやMycは向かない気がする。あと難しいことは生化学とかそっち系の専門家に聞いて。

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No.4391-4 - 2015/09/02 (水) 22:46:59 - おお

そう言う実験はもうestablishされていて文献を見ればすぐわかるのではとおもいますが。
ユビキチンなどでやっているアプローチも参考になると思います。

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No.4391-3 - 2015/09/02 (水) 11:15:58 - kuwman

失礼しました。NEED8ではなく、NEDD8です。

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No.4391-2 - 2015/09/02 (水) 11:12:15 - nn

NEDD8?