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(無題) 削除/引用 No.4388-17 - 2015/09/09 (水) 02:23:26 - おお >CMV,CAGが転写因子を取り合うことになるかと思いますが、私の予想ではCMVもしくはCAG単独のstableよりも発現量が落ちてしまうのではないかと思っていますが それはなんコピーはいるか、発現した遺伝子の細胞に対する影響などにも左右されるので何ともいえません。CAGのエンハンサーの部分をきりとってCMVプロモーターに戻してからtransfectionします?。。。 何でわざわざっていう感じはしますけど。。。

(無題) 削除/引用 No.4388-16 - 2015/09/08 (火) 22:03:10 - TS >IRESベクターを２つ持つstableを作った場合ワークするのでしょうか？ えーと、何がしたいんでしたっけ。 ２つのタンパクを同時に強制発現させたいんじゃなかったでしたか。 http://www.invivogen.com/pvitro こういうのはダメ？

(無題) 削除/引用 No.4388-15 - 2015/09/08 (火) 17:17:10 - kero 皆様お返事いただきありがとうございます。お返しが遅くなりすみません。 おおさん お教えいただいたベクターが購入できるなんて知りませんでした。本当にありがとうございます。これだと薬剤セレクションもできるので非常に良いですね。 経験がないのでおしえてほしいのですが、 IRESベクターを２つ持つstableを作った場合ワークするのでしょうか？ またCMVの場合でも、CMV-A gene/CMV-B geneのようにCMVプロモーターの活性によって発現するA、Bはちゃんと機能するのでしょうか？ またIRESが２つ、CAGが１つ、CMVを２つもつstable cell lineを作ったとすると、それは理論的にはワークするのでしょうか？ CMV,CAGが転写因子を取り合うことになるかと思いますが、私の予想ではCMVもしくはCAG単独のstableよりも発現量が落ちてしまうのではないかと思っていますが、stableなので飼っているうちにある程度問題ないくらいの発現量に落ち着くのかな？落ち着けばいいなと考えています。 ご意見いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4388-14 - 2015/09/03 (木) 23:19:28 - おお >ということは片方のプラスミドの薬剤耐性マーカーを制限酵素などでつぶしておいて、 精製後に切り出すとか、カットをいれて機能しないようにしてそのままtransfectionするという意味です。作り直すといういみではないです。

(無題) 削除/引用 No.4388-13 - 2015/09/03 (木) 23:16:39 - おお ちょっと思い出したのですが、たとえば手持ちのハツゲンベクターに薬剤耐性マーカーがないときに、薬剤マーカだけを持ったプラスミドをごく少量混ぜてtransfectionしてセレクションするという手をとることがあります。 ということは片方のプラスミドの薬剤耐性マーカーを制限酵素などでつぶしておいて、もう一つのプラスミドとtransfectionするという手が取れるかもしれません。 ただシングルクローンをとって発現しているものを選ぶのがこの手の方法では無難かと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.4388-12 - 2015/09/02 (水) 23:53:18 - TS すみません。 IRESのことです。

(無題) 削除/引用 No.4388-11 - 2015/09/02 (水) 23:52:02 - TS g418のセレクション以外の方法でもいいなら ireasを使ったプラスミドにするのは？ 二つの遺伝子までなら。

(無題) 削除/引用 No.4388-10 - 2015/09/02 (水) 22:12:38 - おお >[Re:9] keroさんは書きました : > 切り貼り面倒ですがやはりやったほうが良さそうですね。 > 複数のベクターを持つ安定発現株を作製予定で、慎重に選ば無いといけません。 > 細胞の性質が変わる可能性があるためシングルクローンを取ってくる方法は考えていません。 > > そのブラントエンドにしてライゲーションする方法についてですが、例えばCMVとCAGのベクターを繋げるとどっちもちゃんと機能するのでしょうかね？ 薬剤耐性(neo)とかはSV40で、発現したい蛋白はCMVだったりするプラスミドは多いと思います。integrationは同じ箇所に複数はいったりよくするときいたことがありますので、2つのプラスミドをつかっても同じような状態でのゲノムへのインサートになることはよくあるような気がします。 > そのようなプロモーターが２つ入っているベクター自体見たことがないのと、２つ繋げると大体10kくらいの大きさになるので細胞に入りにくいだろうなと思いました。 > > 色々suggestionをいただいているのにすみません。 ttp://oxfordgenetics.com/plasmid-products/promoter/mammalian-promoters/constitutive-mammalian/dual-promoter-expression-plasmid-psf-cmv-pgk-detail ttp://oxfordgenetics.com/plasmid-products/antibiotic-selection/mammalian-selection/puromycin/psf-cmv-cmv-sbfi-ub-puro-detail 二つの発現ユニット(マーカーをのぞいて)を持つプラスミドは何社かで扱っているのをみたことはあります(昔のstratageneでも見たような身がします)。 たしかにサイズは大きくなりますので、難しい細胞なら効率は悪くなる可能性はあるかもしれません。まあアイデアだけなので、検証も含めて実験しないといけないのでそれも面倒といえば面倒ですね。

(無題) 削除/引用 No.4388-9 - 2015/09/02 (水) 21:11:33 - kero 切り貼り面倒ですがやはりやったほうが良さそうですね。 複数のベクターを持つ安定発現株を作製予定で、慎重に選ば無いといけません。 細胞の性質が変わる可能性があるためシングルクローンを取ってくる方法は考えていません。 そのブラントエンドにしてライゲーションする方法についてですが、例えばCMVとCAGのベクターを繋げるとどっちもちゃんと機能するのでしょうかね？ そのようなプロモーターが２つ入っているベクター自体見たことがないのと、２つ繋げると大体10kくらいの大きさになるので細胞に入りにくいだろうなと思いました。 色々suggestionをいただいているのにすみません。

(無題) 削除/引用 No.4388-8 - 2015/09/02 (水) 20:46:18 - 真横 > Tをつけるとは具体的にどのような方法でしょうか？ TAクローニングの応用ですね。 Aの付け方がわかれば、Tの付け方もわかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.4388-7 - 2015/09/02 (水) 19:33:36 - 横 >もう一方をTをつけて、 横からすみません。 Tをつけるとは具体的にどのような方法でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4388-6 - 2015/09/02 (水) 11:12:33 - おお たとえば、両方をブラントの、発現ユニットを壊さない酵素できっておいて、片方をTaqでAをつけて、もう一方をTをつけて、1:1でligationしてタンデムにつながったDNAを電気えいどうで回収してそれをtransfectionすると、両方の発現ユニットをもつプラスミドを直さにしてtransfectionしているようなもんだから、両方発現する株はとれやすいかなぁと。 両プラスミドを含む1本のDNAを作るのはいろいろやり方をねることはできるだろうし。

(無題) 削除/引用 No.4388-5 - 2015/09/02 (水) 10:00:10 - TS 手間を考えると、トリッキーなセレクションをして苦労するよりも 乗せ換えた方が早いような気がするし、気持ちもすっきりするなぁと思います。 アイデアとしては、限界希釈法などでモノクローンが確かに取れるなら、 取ったものを免染とかで選別するという方法もとれるかも。 タグ付きのタンパクならEndogenousのものを染めずに済むかな。 増やしていく途中で、各クローンを２つのプレートなりにわけて、 片方を解析に使えば、もう片方が増えている間にやればいいですね。 G418の濃度も上げておけば、ダブルポジティブのクローンは増えるのかも。

(無題) 削除/引用 No.4388-4 - 2015/09/02 (水) 09:41:10 - おお アイデアがあるかといえばありますが、アイデアなので、、、まあそれは時間があったら書いてみます。 切り貼りぐらいはそんなに大変ではないとは思いますが、どうしてもというならadgeneとかで出来合いのものを探してみるとか、文献から作った人に問い合わせて譲ってもらうとかというのもありかと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.4388-3 - 2015/09/02 (水) 08:52:06 - あ G418の濃度を上げるかな。 同じものが複数入るものもできるかもしれませんが，選別は可能かと思います。

(無題) 削除/引用 No.4388-2 - 2015/09/02 (水) 08:21:32 - たていす ＞切り貼りの手間もかかると思われるため そうかなあ？

２つのG418耐性遺伝子に対する薬剤セレクション 削除/引用 No.4388-1 - 2015/09/02 (水) 08:08:30 - kero G418耐性遺伝子を持つベクター２種を持つ細胞株を得る良い方法はありますでしょうか？ 耐性遺伝子を別のものに変えてそれぞれセレクションすれば良いのかもしれませんが、切り貼りの手間もかかると思われるため、何か良い方法はありますでしょうか？

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