いつも参考にさせていただいております。
ChIP実験を最近始めたのですが、ホルマリン固定後のサンプルをIPできるのか確認したのですが、目的の分子量よりも高めにバンドが出ていました。
行った実験としては、固定後にソニケーションを行い、遠心後の上清をタンパク定量し、IgG-dynabeads、目的の抗体-dynabeadsにそれぞれ等量のライセートを入れてオーバーナイトしました。翌日マグネットで沈降し、その上清をアセトン沈殿し、抗体-beadsに結合しなかったタンパクを確認するためのサンプルとして調製。また余ったライセートをnon-IPサンプルとして調製しました。
まとめますと、
IP-IgG
IP-目的抗体
sup.-IgG
sup.目的抗体
input
でウエスタンを行うと、input(40ug protein)でもバンドが結構薄く、さらに通常確認できる高さよりも5〜10?ほど高めにバンドが検出されました。
ホルマリン固定することでタンパク-タンパク、タンパク-DNAの結合が強固となるため少し上にバンドが検出されるのかと考えていますが、この考えは正しいのでしょうか？
またheavy chainと思われるIPしたサンプルのバンドも55kDaほどに検出されています。また50kDa付近にはバンドがないので55kDaがheavy chainと思っています。
ソニケーションが十分かどうかもDNAをinput DNAを調製しアガロース電気泳動により約200bにバンドを検出しております。少しスメアを引いていますが。この結果より固定とソニケーションは問題ないと考えています。
またChIP DNAは濃度を測って検量線を引き、qPCRをかける必要があるのでしょうか？その際微量DNA測定用の機器Qubit?等が必要かと思いますが、ラボにない方はどのように%inputを算出しているのでしょうか？
初心者ですのでたくさんご意見いただけると助かります。
よろしくお願いいたします。 |
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