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(無題) 削除/引用 No.4382-22 - 2015/09/09 (水) 15:54:19 - azuma AP 様 文献をありがとうございました。ToyoboカタログによりますとrTth DNA PolymeraseはリアルタイムＰＣＲ用ですが、サンプルの問い合わせ中です。

(無題) 削除/引用 No.4382-21 - 2015/09/09 (水) 15:00:27 - AP ちょっと文献を漁って見たら、意外にもTaq系（AmpliTaq Goldを含む）は阻害物質に感受性が高くて、耐性が高いのがrTthだというんですね（古い論文なのでアーキア由来などの最近出た酵素は載っていない）。 rTthは3' exo活性はなかったはず。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9758794

(無題) 削除/引用 No.4382-19 - 2015/09/09 (水) 12:54:49 - azuma 中年　様 ご興味を示していただいて、ありがとうございました。ＣＴＡＢで試してみます。AP様がおしゃったようにDNAが少ないサンプルですので、カラムですとＤＮＡのロースで、ほとんど取れませんでした。おそらく、最初のＤＮＡ濃度は高かったら、カラムでの精製は一番いいではないと思います。 おお様 情報をありがとうございました。検討したいと思います。 hana様 ご関心を持っていただいてありがとうございました。 ご提案をなさった装置を試してみましたが、結果が改善しなかったです。 本日、PCR inhibitor removal kitをもらったので、試してみます。 AP 様 TaKaRaのMightyAmpは改善しなかったですね。KAPA2GRobustはサンプルの問い合わせ中です。

(無題) 削除/引用 No.4382-18 - 2015/09/09 (水) 10:07:03 - hana メラニン過多でPCRがかからないのでしたら、 DNAを希釈するだけでもかかる場合があります。 ・10倍希釈 ・BSA使用 ・nested PCR これでダメなら後回しにしますね。

(無題) 削除/引用 No.4382-17 - 2015/09/08 (火) 14:44:29 - 中年 なるほど、たしかに仰るとおりですね。 > おそらく扱っているのは電気泳動で可視化したり回収したり出来ないほどの微量サンプルだと思いますよ。 メラニンの除去については検索すればいろいろ出てきますね。簡単な方法なので試してみる価値あるかも。 http://1000.fungalgenomes.org/home/protocols/removal-of-melanin/ http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1687157X13000036

(無題) 削除/引用 No.4382-16 - 2015/09/08 (火) 14:32:32 - おお >Qubit 色素の蛍光はそのシステムでは引っかからないのでしょうか? PEGチンとかだったらどうだろうかと頭によぎりましたが、、、ちょっとわかりません。 あとマグネティックビーズベースでアセチル基をたぶんつけたやつがDNA精製に使えるとかあったようなきがしますが、APさんが紹介したものにはいってるかな、、、 それかどうかはおいておいて、Pcr inhibitorsを意識したキットはいろいろ売っているようです。 ttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4318930 ttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4463351

(無題) 削除/引用 No.4382-15 - 2015/09/08 (火) 14:27:46 - AP おそらく扱っているのは電気泳動で可視化したり回収したり出来ないほどの微量サンプルだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.4382-14 - 2015/09/08 (火) 13:28:10 - 中年 サンプル数の規模によっては現実的でないかもしれませんが、アガロースゲルで泳動してバンドを回収すればたいていのコンタミは除けるのではないでしょうか。PCRのクロスコンタミが問題になるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.4382-13 - 2015/09/08 (火) 12:55:10 - azuma おお　様 ご興味をありがとうございました。 実際はどうなっているのかは分かりませんが、感じたこと 　PCI法の場合、ＤＮＡ収量はその中に一番多かったと思います。しかし、着色があり、これはinhibitorsではないかと思います。 　カラムは、なんとなく純度の高いＤＮＡが取れますが、なかなか収穫量が少ないようです。もし、最初からＤＮＡの量は多ければ、カラムの方がうまく出来るという報告があるようです。 　シリカビーズは試薬組成やpHなどで結果がまちまちなのようで、今のところもうちょっと検討が必要ではないかと思い、取り組んでいます。 昨日、ＰＣＩの直後、Isopropanol で、3M 酢酸ナトリウム1/10,pH5.2、（20℃、３０分間、14000ｇ）遠心でもDNAが取れなかったようです。QubitにてＤＮＡはToo LowとPCRが増幅なしの結果でした。因みに、試料は動物の毛（黒色）で24h以上proteinase Kで溶解したものです。

(無題) 削除/引用 No.4382-12 - 2015/09/08 (火) 07:53:35 - おお >PCI法、シリカのカラム、シリカビーズ メラニンなどはこれらではあまり効率的に除けないんじゃないかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4382-11 - 2015/09/07 (月) 22:46:52 - azuma AP 様 ご助言をありがとうございました。 それについてさらに勉強させていただきます。 また、行き詰まれば相談させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.4382-10 - 2015/09/07 (月) 16:49:42 - AP ちなみにどちらの酵素も結構な量の試供品がもらえるはずです（それぞれタカラと日本ジェネティクスから）。

(無題) 削除/引用 No.4382-9 - 2015/09/07 (月) 16:39:21 - AP クルードに強いとうたっているPCR酵素でも、MightyAmpとかKAPA2GRobustなんかだと3' exo活性はないですよ（おそらくTaq polベース）

(無題) 削除/引用 No.4382-8 - 2015/09/07 (月) 16:18:23 - azuma AP 様 いつもお世話になっております。 早速ご助言をありがとうございました。 KOD FX は、AP様がおっしゃったように、確かにクルードサンプルには強く、当方も気に入れていますが、どうやらKOD FXを含め、多くのクルードサンプルに強い酵素はだいたいProofreadingの働きがあり、こちらの試験である動物種の区別に使用するプライマーではうまく出来ませんでした。具体に言いますと、本来ウシＤＮＡにしか反応しないプライマーでもKOD FXでGenotypingするとヤギのＤＮＡにも反応してしまいます。もし、この試験はKOD FXでも判別できれば、一番やりやすい方法ではないかと思います。しかし、当方は現状では、KOD FXをうまく利用し、特異性を出すための知識がないため、３’活性を持たない酵素を絞って、試験を行っています。これについても以前こちらのフォーラムでいろいろな方にお世話になっておりました。確か、３’活性を持たない酵素を使うことによって、正確でGenotypingが出来ました。しかし、どうも、そのような酵素は純度の高いDNAを要求するようです。 AP様がお勧めのように、次はChelex100方法で抽出してみます。また、Silica Bead法についても、もうちょっと検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4382-7 - 2015/09/07 (月) 15:26:48 - AP 使う酵素に因るところも大きいと思います。 クルードサンプルに強いことをうたっている酵素なんかを使ってみては。 実際には酵素そのものより添付バッファーに何かしらのサプリメントが入っているということみたいですが。 私が使った中ではKOD FXが気に入っています。通常のPCR実験に十分な正確性を持ちながら、クルードにも強い、他の酵素で増えなかったテンプレートもこれにしたら増えることが多いです。添付バッファーは2xでやや粘性があり凝固点もずいぶん低いような、というところからして、やはり何かサプリメントが入っているようです。PVPかな。 私とは分野違いですが、先にもちょっと触れたように、植物や土壌由来でポリフェノールで着色しているようなサンプルにはPVP添加でPCRがかかるようになるとか。 テンプレートDNAの精製法としてはChelexをお試しになったことは？阻害物質をよく吸着して除去してくれるそうで。そういえばChelex法の初出はFBI関係からじゃなかったかな。

(無題) 削除/引用 No.4382-6 - 2015/09/07 (月) 14:41:25 - azuma Forensic分野でもアルブミンによるinhibitorの緩和がとりあげられますが、当方の試験結果では緩和よりはむしろTaqの働きを邪魔する結果になり、変な結果になりました。当方はQIAGEN Fast Cycling PCR KitとAmpliTaq Gold 360の両方では改善が見られなく、AmpliTaq Gold 360では障害が見られました。inhibitorはなかなか難しいようですね。 　ＤＮＡ抽出に関する文献をいろいろ読みましたが、方法は多様でどれ採用するかは迷っちゃいます。これまで、PCI法、シリカのカラム、シリカビーズを試していました。しかし、まだ、満足できないです。特に黒い色のサンプルはＰＣＲがなかなか成功しませんでした。なにか良い方法がないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4382-5 - 2015/09/01 (火) 12:40:03 - azuma AP 様 文献をありがとうございました。 参考させていただきます。 BSAをまず試してみます。

(無題) 削除/引用 No.4382-4 - 2015/09/01 (火) 11:07:33 - AP ヒントだけだしたら、あとは文献検索で見つけるだろうと思っていたのですが、念のため、 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X00927165 http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/1998/October/Bovine-Serum-Albumin-Reverses-Inhibition-of-RT-PCR-by-Melanin/biotechniques-39781.html melaninは好熱性DNAポリメラーゼに直接結合し、200 ng/mLという非常に低い濃度でも阻害するそうです。 PCR反応にBSAを添加がするというのがポピュラーな対策です。 他にもPVP（主としてポリフェノール等への対策）とか、阻害物質を中和する添加物は色々報告がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.4382-3 - 2015/09/01 (火) 09:52:57 - azuma AP様 ごコメントをありがとうございました。 ご指摘するように、確かフェノールクロロの後、黄色の着色がありました。 カラムやfilterによりろ過することで透明になりました。その後、濃度を希釈したり、Nippon GenのT4 gene 32を使ったりしましたが、増幅が不安定でした。T4 gene 32を入れると改善する場合がありました。

(無題) 削除/引用 No.4382-2 - 2015/08/31 (月) 23:08:44 - AP メラニンは典型的な阻害物質。 それを回避する抽出法や添加物は数々報告があるはず。

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