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(無題) 削除/引用 No.4365-8 - 2015/08/28 (金) 03:01:06 - 晴れのち曇り asanさん、MPさん、 ご回答ありがとうございます。 combimagの存在は存じ上げませんでした。 もし、どうしても導入が困難な場合、確認してみます。 ５FUの5日間処理は試したことがございます。 というのも、他のベクターに関しては ５FUの5日間処理で行っているからです。 5日間投与すると、in vitroでの増殖がさらに確認しにくくなり、 やはりほとんど導入できていません。 他研究室の方は 使用しているマウスの系統がわるいのではないか、ということです。 骨髄に関する遺伝子欠損の影響は報告されていませんが、 プロトコル、そして実際にマウスを見て、 プロトコルに関してはそんなに悪いとは思わない、 しかしマウスが明らかに小さく、骨髄細胞数が少ないので、 ５FUの影響が強く出るのではないか、ということです。 ５FUの投与量を調べることよりも、 ５FU投与以外の方法を検討するほうがよさそうです。 LSK細胞を用いてみます。

(無題) 削除/引用 No.4365-7 - 2015/08/27 (木) 22:05:51 - asan 5-FUなしだと死なないならば、インフェクション以前の問題が大きいような気がします。 自分が見た事あるプロトコールでは5-FU処理は5日ぐらいするものが多い気がするんですが短すぎたりはしませんか？完全に死にきってないので、結果的に未分化でないものがdepletionしきれてないという可能性ありますね。KSL分画をソーティングするような方法はちょっと面倒ではありますが、多分5-FUの方法よりも厳密ではあると思います。 いずれにせよ、MSCVを使ってるならば血球系や幹細胞系細胞（マウス）でインフェクションできないことはないはずですよ。自分はやってませんけど、やってた人は結構検討して結局30%ぐらいしか入らないけど大体普通の論文もこんなもんだとのことですよ。どうしても入らないならば、別の方がのべてるようなmagnefectionをするようなプロトコールやspinfectionなんかも含めて検討する必要はあるかもしれません。基本的にレトロウイルスは増殖しないと組み込まれないので、もしかしたら5-5FU処理の上手い時間とかの調節で、細胞分裂を活発にさせたりもしてるのかは分かりませんが。 ラボで王道のプロトコールが無い場合は、思い切ってその手の実験を得意とするラボに詳しいやり方を聞くとか、思いきって教えてもらえるか聞いてみた方が自分で闇雲にやるよりも、手っ取り早くて確実だったりもしますよ。免疫(TとかB)をやってるラボなら大抵この手の実験はひととおりできると思うので。大学とか研究機関内に教授や自分自身の知り合いのラボがあれば話は早いんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.4365-6 - 2015/08/27 (木) 12:15:18 - MP 下記の論文ではcombimagを使ったmagnetofectionで入れてます。 http://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(13)00045-7 何かの雑誌かパンフレットの記事にこの論文の著者が出てて、magnetofectionでようやくうまくいったみたいなことを言っていたような気がする。 ただ試薬が高いのとマグネットを買う必要があるのがネックですね。

(無題) 削除/引用 No.4365-5 - 2015/08/27 (木) 11:30:31 - 晴れのち曇り ppeさん、 ご回答を賜りありがとうございます。 ５−FU未処理の骨髄細胞を用いた場合、 遺伝子導入しなければ同じ培養条件でほとんど死細胞は出現しません。 ppeさんのご指摘の通り、 ５-FU未処理で遺伝子導入を（こっそり）試してみようかと思い、 本日仕込む予定です。 もし、5-Fu処理の影響であるならば、 Lineage negative sortingやLSK細胞の使用も検討を考えます。 データで教授を黙らせます。 Crudeの使用は教授が認めてくれません。 ただ、不思議なのは 論文を読むと、多くのpaper（海外発ですが）が lentivirus, retorovirus問わず、 私とまったく同じ条件で遺伝子しています。 彼らは本当に8割もレトロウイルスベクターで 遺伝子導入できているのでしょうかね。。。 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4365-4 - 2015/08/27 (木) 11:09:16 - ppe 5-FUの副作用で骨髄細胞に影響あるのは有名みたいですけど。 血清のロットが合っていないとか、溶血の条件がおかしいとか、ウイルスの毒性が高いとか、いろいろありそうですが、まずは無処理のマウス骨髄細胞が現時点の条件で培養および遺伝子導入が可能かどうかを確認すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.4365-3 - 2015/08/27 (木) 10:38:42 - 晴れのち曇り おおさん、 返信ありがとうございます。 私が使用しているレトロウイルスベクターは、 Foamy virus vectorという、主にアメリカで 遺伝子治療用のベクターとして臨床研究が進んでいるベクターです。 アメリカの某研究所よりいただきました。 本ベクターは論文を読むかぎり、エコトロピックではないはずで、 犬、ヒト、マウスに共通して遺伝子導入可能なはずです。 しかしおおさんがおっしゃる通り、 分譲していただいた施設はヒト検体しか用いておらず、 当研究室でも誰もマウスで試したことはありませんでした。 遺伝子導入が容易なマウス細胞株で（こっそり）確かめてみます。 骨髄細胞を回収後すぐ、そして2日間培養後で遺伝子導入の両方を 試してみたのですが、両方ほとんど感染が確認できていません。 そもそも、マウス骨髄細胞は翌日、半分ぐらい死んでいます。 これは５FU処理後において正常なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4365-2 - 2015/08/27 (木) 06:04:31 - おお レトロのパッケージングのプラスミドはなんでしょうか?マウスははいるがヒトは入りにくいとかあるので(その逆はどうだったか思い出せませんが)。 死細胞がおおいとのことですので、まいて何日か培養してから感染ではだめですか?

レトロウイルスを用いたマウス骨髄細胞への遺伝子導入 削除/引用 No.4365-1 - 2015/08/25 (火) 10:12:44 - 晴れのち曇り いつも勉強させていただいております。 現在、マウス骨髄由来浮遊細胞へレトロウイルスベクターを用いて 遺伝子導入を行っているのですが、大半の細胞が死んでしまいます。 遺伝子導入法は、論文（Mindy Lo, et al. Blood. vol.94(9), 1999:pp3027-3036、など）を参考にしております。 すなわち、5-FUを150 mg /kgマウスにipにて注射します。 2日後に大腿骨、脛骨よりマウス骨髄細胞を注射器（23ゲージ） と冷たい2%FBS入りPBSを用いて回収し、 細胞をNH4Cl,KHCO3,EDTAを含む溶血剤にて10分室温で溶血し、 DMEMに20%FBS、20 ng / mL mIL3, 100 ng /mL mSCF, 50 ng /mL mIL6を 添加した培養液で2日間培養します。 その後、20 ug / cm2のレトロネクチンでコーティングした 12 well plate上に細胞濃度5×10^5 cells / wellでTurk's solutionで計測した細胞を播種し、レトロウイルスベクターをMOIをふってovernightで感染させ、翌日培養液交換を行っています。 このとき、ウイルスを入れていないwellにおいても遺伝子導入２日後、 半数程度の細胞が細胞死を起こしており、qPCR titerでMOI=100でも 7日目に感染が全く確認できません。 レトロウイルスベクターは２９３T細胞を用いて、搭載遺伝子の発現が 確認できています。プロモーターはmscvです。 皆様、レトロウイルスベクターを用いてマウス骨髄細胞に遺伝子導入可能で しょうか。また、どれぐらいの導入効率で、その際、どれぐらい死細胞は 出現していらっしゃいますか。 つたない日本語で申し訳ございませんが、ご教授お願いいたします。

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