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(無題) 削除/引用 No.4364-20 - 2015/08/31 (月) 13:46:21 - 橘 今話題になっているのはシーケンス反応の前処理であって、シーケンス反応の後処理ではありません。 そもそも、EDTA＋エタ沈は「公式に」推奨されている処理の一つですよ。

(無題) 削除/引用 No.4364-19 - 2015/08/30 (日) 09:22:50 - tech 知人に面白い方法を紹介してもらいました。 Bigdyeを十分に希釈した状態で、サイクル数を増やすとddNTPがなくなり、 EtOH-EDTAで十分だそうです。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.4364-18 - 2015/08/26 (水) 10:07:56 - 7744 ExoSAP-ITは取説通りにやるとコストがかかるけど、１サンプル0.1マイクロリットルで十分なので、処理コストは１サンプル５円ぐらい。 方法も、PCRプロダクトに、水とPCR用のバッファーとExoSAP-ITを混ぜたものを加えて、サーマルサイクラーで３０分反応させるだけ。１００サンプルでも２００サンプルでも簡単です。 むしろなぜダイレクトシーケンスにExoSAP-IT以外の選択肢を選ぶのかが不明なぐらい。

(無題) 削除/引用 No.4364-17 - 2015/08/25 (火) 20:17:15 - 横 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4364-16 - 2015/08/25 (火) 20:10:48 - AP はいそのとおり、8Kの間違いです。

(無題) 削除/引用 No.4364-15 - 2015/08/25 (火) 20:02:19 - 横 ＞ PCR反応液に0.6 volの2.5 M NaCl/20% PEG800 (5 M NaClと40% PEG800のストック溶液を等量ずつ混合） PEGは8000を使っていますが800でもできるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4364-14 - 2015/08/25 (火) 18:35:50 - AP そやね。

(無題) 削除/引用 No.4364-13 - 2015/08/25 (火) 18:28:48 - exo polymeraseによって産物が削られるというリスクはExoSAP-ITを使っても同じではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4364-12 - 2015/08/25 (火) 16:20:56 - AP （ちょっと勘違いしていたので、一旦削除して書き直しました） スピンカラムによるゲルろ過（サイズ排除クロマト）でのPCR産物の精製は、昔良くやっていたのですが（MicroSpin G-25/50等)、最近は基本的にやりません。 というのは、近頃のPCRは校正活性のある酵素でやるのがあたりまえになっていますが、ゲルろ過したときに、理論的にPCR産物と酵素が落ちてくると思うんですよ。基質のdNTPが除去された状態で校正活性のある酵素が共存するとPCR産物を末端から削っていく可能性があると思うんです。 MicroSpinの説明書にも酵素を除く必要があるときはその前にフェノール抽出などで酵素を除くように書かれていました。

(無題) 削除/引用 No.4364-10 - 2015/08/25 (火) 14:28:53 - おお そういえば96wellフォーマットでPEG沈でくろうしてたひとがいたっけ。遠心力がかせげないし溶液も粘性があるしやりにくいかもしれないので、PEGでやるなら1.5mlチューブなどのフォーマットにするとかしたほうがいいかも。まあ最近いろいろ出てるからそこまでしないですむかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4364-9 - 2015/08/25 (火) 13:58:06 - AP PEG/NaCl沈殿でも可能です。ExoSAP-ITが買えないとき（金がないとき）はこれでやります。これもワンチューブでEtOH pptの要領で遠心するだけなので多サンプル処理に適しています。 PCR反応液に0.6 volの2.5 M NaCl/20% PEG800 (5 M NaClと40% PEG800のストック溶液を等量ずつ混合）入れてvortex、4℃または氷水浴で30分置いた後、EtOH pptの要領で遠心、70% EtOHリンスです。 もともとこの方法は、サンガー法の鋳型にするプラスミドから、非特異的なプライミングを起こす断片化したRNAを取り除くために考案されたもので、PCRプライマーもこの方法で除去できます。

(無題) 削除/引用 No.4364-8 - 2015/08/25 (火) 13:08:22 - おお どうだろうPEG沈はつかえるかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4364-7 - 2015/08/25 (火) 13:05:49 - おお ゲル濾過タイプだとえんしんして余分な水分をカラムから除いて、reserverのチューブを交換してサンプルをのせてえんしんすれば、精製できるのでqiagenなどのシリカたいぷよりは早いでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.4364-6 - 2015/08/25 (火) 12:59:02 - おお ゲル濾過のスピンカラムが早いんじゃないかな。ばあいによっては96well フォーマットでもいいし、前いたらぼは96wellフォーマットでたしか自分でゲルをつめてたと思う。 G-50を粉末で買ってかけるようにかぶせてfillして水かTEをいれてオーバーないととかだったかな。。。けっこう膨潤するけど、、、どうしてたかなっていうのはあるけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4364-5 - 2015/08/25 (火) 12:56:28 - AP 多サンプルを扱うときカラムだと、コストもさることながら、アプライ、洗浄、溶出のリキッドハンドリング、遠心の繰り返しで手間が大変です。一度に扱える数も遠心機のキャパに依存するし。96ウェルフォーマットのカラムでも使えばまだしも。コスト的な問題よりも、そっちの方がプラクティカルには大問題です。 その点、ExoSAP-ITはワンチューブ（ワンウェル）反応だけですので、多サンプル処理に適しています。

(無題) 削除/引用 No.4364-4 - 2015/08/25 (火) 12:06:49 - 中年 ディスポのスピンカラムにバルクで買ったセファクリルS-400を詰めなおしたものを使ってゲルろ過しています。

(無題) 削除/引用 No.4364-3 - 2015/08/25 (火) 10:21:48 - AP dNTPもそうだけれど、肝心なのはPCRプライマーを除くことにあります。

(無題) 削除/引用 No.4364-2 - 2015/08/25 (火) 10:19:16 - AP ExoSAP-IT 結構なお値段ですが、PCR産物の投入量を必要最小限にするとか、また、もともとキャパに余裕があったりするので、一サンプルあたりの使用量は1/10から1/20くらいまで抑えられます。

Direct sequencingの前処理について 削除/引用 No.4364-1 - 2015/08/25 (火) 10:04:40 - 向日葵 標題の件でご相談させてください。 現在、人サンプルの遺伝子配列解析を行っています。 手段としては、ゲノムをもとにPCRを行い、キアゲンのスピンカラムで精製した後、DNA sequencingを行っています。 アンプリコンサイズは300bpほどの長さで、これまで失敗なく綺麗に読めています。 ただ、今後サンプルの数が増える予定で、キアゲンのスピンカラムの操作をキットを使わずに出来れば経済的であるのに、と考えています。 PCR後のエタ沈ではdNTPsは完全に除くことができないと言われています。 Sequencingの前処理にキットを使われない方はどのように処理（dNTPsを除いたり、シークエンスの邪魔になるものを除く目的です）をさせていますでしょうか？ 大変稚拙な内容で恐縮していますが、どうかお知恵を拝借させていただけますと幸いです。 よろしくお願い致します。

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