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(無題) 削除/引用 No.436-5 - 2012/04/25 (水) 23:28:14 - リア充 やって悪い事はたぶんないし、できればやった方がいいのかもしれない。でもあくまで自分の経験の範囲からの正直な感想をいうと、「面倒だし別にしなくてもいいじゃね」、という感じです。駄目なときはしっかりプレクリアしてもしなくても駄目だし、上手くいくときもまた、してもしなくても上手くいく。だから非特異的なバックが高いならそれはビーズ自体の性質、試料や試料溶解液、抗体に起因すると考えるし、もっと根本的なところを再検討すべきと思う。すくなくともプレクリアすることで結果が目に見えて改善することはあんまり期待出来ないようにおもう。

(無題) 削除/引用 No.436-4 - 2012/04/22 (日) 13:39:40 - たこ お返事遅くなりました。 pre-clearなしで一度やってみようと思います。 なお、ネガティブコントロールとしては、FLAG融合タンパク質を強制発現させていない細胞を用いて同様の操作を行ったものを使用する予定です。

(無題) 削除/引用 No.436-3 - 2012/04/21 (土) 10:20:19 - モモ プレクリアーはしなくても大丈夫な場合も多いですが。 結合蛋白を同定するためにその後LC/MSをして、さらにキャラクターを調べる予定なわけでしょうから、コントロールとしてプレクリアーをしたビーズについてくる蛋白もSDS−PAGEで流したほうが良くないですか？

(無題) 削除/引用 No.436-2 - 2012/04/20 (金) 08:47:38 - TS 必ずPre-clearしなければダメ、ということではないでしょう。 IPでも、基本的にPre-clearする方法をとる場合が多いですが、問題とならないアッセイ系、サンプルならば、省略しても良いと思います。 やってみて大丈夫なら大丈夫、ということではないかと思います。

Dynabeads使用時のpre-clear 削除/引用 No.436-1 - 2012/04/19 (木) 23:25:26 - たこ 哺乳類細胞でFLAGタグ付のタンパク質を強制発現させ、IPすることで、そのタンパク質に結合するタンパク質を共沈させようと考えています。共沈したタンパク質の同定は、SDS-PAGE後にMSで同定する予定です。 予定ではDynabeadsに抗FLAGタグ抗体を結合させてIPし、FLAGペプチドで溶出後にSDS-PAGEを行うことを考えております。 ひとつ悩んでいることは、pre-clearをするかどうかです。 Dynabeadsは非特異的吸着が少ないようですし、仮にDynabeadsおよび抗FLAGタグ抗体に非特異的に結合するタンパク質があっても、FLAGペプチドで溶出するので、SDS-PAGEへの持ち込みも無いのではと考えています。また、研究室の予算を考えると、Dynabeadsは高価なので、ケチれるにこしたことはありません。 このような実験系では、pre-clearしなくても問題ないものでしょうか？

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