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(無題) 削除/引用 No.4359-7 - 2015/08/27 (木) 06:58:07 - capek trewさん、返信ありがとうございます。 正常な細胞で血液分化させた際には死細胞はほとんど出現せず、普通に分化させることができています（分化は特定の一つのlineageでなく、混ざったものを分化させるような条件です）。 血球分化や細胞増殖・生存に関わる種々の遺伝子のノックアウトやミュータントなど、ゲノム編集した細胞で分化中に死細胞が大量に出現します。 死細胞が出現する事自体は求める結果ですので、死細胞を増やさないような培養条件を探したいわけでは無く、既に死細胞がある状態から生存細胞のみを取り出すことが目的です。 ご指摘のように培養規模を増やせば少ない細胞でも回収できますが、株数も多くて資金も限られていますので、なるべく小さいスケールで実験したいのでまずは今のスケールで死細胞を除くことを考えて、不可能ならばスケールアップを試みたいと思います。 MPさん、返信ありがとうございます。 7AADネガでソートしてみました。 多少ロスしましたが、これまでに試みた他の方法よりはマシでした。 行けそうな感触です。

(無題) 削除/引用 No.4359-6 - 2015/08/26 (水) 10:42:32 - trew すいません、まったく参考にならないかもしれませんが、 現在培養中の細胞をギムザ染色等で確認したことがありますでしょうか。 かつて私がヒト多能性細胞より血球系細胞に分化誘導した経験からしますと、 Gran（Neu）、Mono、T、Meg、DC、Erythroid に関しまして、細胞増殖が死細胞を下回ることはないと思います。 Eosino、Basoに関しましては、 これは他のすべての細胞系譜が死滅するのを待つのが、 分化誘導（というのか？）の基本だったのですが、 これはラミニンを用いて、 ディッシュに接着させることが可能で、やはり死細胞は培養液に 培養液交換で簡単に除去可能でした。 B細胞、NK細胞は行ったことがありません。 好酸球、好塩基球以外に分化誘導しているのに 大量の死細胞が出現している場合、 私が思うに、培養条件が悪い気がします。 ギムザ染色を行い、目的の細胞（あるいはその前駆細胞） に分化誘導できているか、確認していますか。 マクロファージが優位になっている場合、分化誘導ができていない 可能性があります。 私はEB形成法、あるいはフィーダー細胞との共培養法にて CD34を出現させたのち、磁気ビーズにて純化、 その細胞を用いて目的細胞への分化誘導を行っていました。 造血幹・前駆細胞出現（CD34やCD31陽性細胞群）から目的細胞様培養液 への培養条件の切り替えは タイミングを1日誤ると目的細胞への分化が難しくなると思います。 私はMyeloid系はCD34純化後、 メチルセルロースを用いたコロニー形成試験で確認し、 CFU-GEMMが一番含まれる時期の細胞を用いていました。 Lymphoid系は実際にOP9-DLLを用いて、回収のタイミングをふって 一番初期分化マーカー（すいません、度忘れしました）が 出現するタイミングを選んでました。 培養条件を変えたくない場合、 顆粒球系細胞はディッシュに接着させることが可能かと思います。 そして培養液交換で取り除いてください。 他系譜は磁気ビーズで陽性細胞の分取にて純化可能かと思います。 ヒト、マウス問わず、 多能性幹細胞を用いている以上、ディッシュの20枚や30枚は 簡単に分化誘導に使用可能だと思うので、 目的細胞が少ないのは、理由にはならないかと・・・。 予算の問題の場合、 教授に状況を説明し、競争資金を獲得していただいてください。

(無題) 削除/引用 No.4359-5 - 2015/08/25 (火) 06:35:59 - MP ソーティングはだめでしょうか？ 機器の設定は別の細胞でやっておいて、サンプルをすぐ流せばいけそうな気もするのですが。

(無題) 削除/引用 No.4359-4 - 2015/08/24 (月) 23:23:14 - capek おおさん、colさん返信ありがとうございます。 フィコール分離は前に試みましたが、細胞が少ないためかどうしてもフィコールを吸ってしまってその後のwashでロスが大きすぎて使えませんでした。 また、隣のラボにミルテニのDead cell removal kitがあったので貰って今日試してみましたが、これも細胞数が少ないためかロスが大きくて細胞がほとんど無くなってしまいました。 細胞数は1サンプルあたり3万〜10万個くらいで、生細胞：死細胞が１：１〜１：３くらいです。

(無題) 削除/引用 No.4359-3 - 2015/08/24 (月) 14:34:45 - col ミルテニーから死細胞除去用のMACS kitが出てた気がする。 Lossはするけどね。パーコールがテクニック的に厳しければ試してみても良いかも。 ESやIPSではどうだかはわかりません

(無題) 削除/引用 No.4359-2 - 2015/08/23 (日) 09:50:52 - おお パーコールとかつかったらだめかなぁ

死細胞除去の方法 削除/引用 No.4359-1 - 2015/08/23 (日) 08:35:07 - capek iPS細胞やES細胞から血液系の細胞を分化させる実験をしています。 分化させた細胞に死細胞が結構な割合で含まれていて、死細胞が邪魔になる実験をするので死細胞を除去したいのですが、どのような方法があるでしょうか。 遠心して比重の違いで除こうと色んな遠心力で試しましたが、細胞数が少ないせいかロスが大きくてダメでした。 死細胞除去用のキットなど販売されていますが、まだ試していません。 細胞は様々な血球の様々な分化段階のものがゴチャゴチャに混ざった状態で、細胞が死んでいることは7AADやトリパンブルー染色で確認しました。 細胞は培養中に少ししか増殖しません。 死細胞除去によい方法があれば、ご教授下さい。 よろしくお願いします。

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