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HepG2細胞での低酸素培養下erythropoietin産生 トピック削除
No.4355-TOPIC - 2015/08/21 (金) 05:57:05 - mm
いつも大変勉強させていただいております。
HepG2細胞におけるエリスロポイエチン発現を調べる実験を始めました。HepG2細胞は、低酸素下でエリスロポイエチンを産生することが古くから文献でいわれていますので、これを再現すべく実験をおこないました。過去の報告では、１％O2下、24時間培養しますと、正常酸素下培養時にくらべ、約10〜20倍のmRNA発現上昇がおこるといわれております。
しかし、私が同様の実験をおこなったところ、ごくわずか（約2倍程度）の発現上昇しか認められませんでした。ちなみに、解析はrealtime qPCRでの結果です。
エリスロポイエチンのｑPCR primerを変えたり、また別のHepG2細胞を試したりしてみましたが、やはり顕著なエリスロポイエチンmRNA発現上昇は認められませんでした。
原因がわからず、困っております。低酸素用のincubatorが別の建物にあるのを利用しているので、回収の時には、sampleを自分のラボに歩いて持ってきて回収しているのですが、そのような短期間で遺伝子発現がかわってしまうこともないような気がしております。
何かよきアドバイスをいただければと思い投稿させていただきました。なにとぞよろしくお願いいたします。
　
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No.4355-6 - 2015/08/21 (金) 14:22:48 - mm
おおさん＞ありがとうございます。Hep3bもこの手の実験ではよく使われています。近くにHepG2があったのと、最終目的はほかの細胞でEPOを産生させることなので、ただのポジコンがほしかったわけです。qPCRについては、多くの論文が出ているので、過去の結果はあまり疑っていません。また、自分の結果についても問題はないと考えております。

(無題) 削除/引用
No.4355-5 - 2015/08/21 (金) 13:52:57 - おお
もし、細胞を持ち帰っているときの影響だとしたら、なんだか結果が日によってばらつきそうですが、、、

フラスコ(ふたにベントようのフィルターがツイてないやつ)を使うのならインキュベーターから出すときにふたを閉めたら密閉できます。

qPCRは定量はどれだけ自信がありますか?
参考にされた文献ではどれほどちゃんとやってますか?まあreferencesが複数出てきそうなのであまり疑う余地はないかもしれませんが、、、ほかのhepatomaではだめですか。hep3bなんかもその手で使われているような印象がありましたが。


と経験がないながらに思いました。

(無題) 削除/引用
No.4355-4 - 2015/08/21 (金) 13:17:00 - mm
YKさん＞文献では安定剤などはいれてなかったです。酸素濃度は、表示されているものがきちんと1% O2を示していたので大丈夫かなと思っていました。チェックする必要があるかもしれません。胎児では肝臓がEPOを作っているようですので、なぜかhepatomaも未分化になるとそのような能力が生まれるんでしょうね。

eel さん＞ありがとうございます。そうですね、5分程度かかります。万全を期すべく、その場で細胞を溶解するところまでやってからラボにもってこようと思います。

(無題) 削除/引用
No.4355-3 - 2015/08/21 (金) 11:06:56 - eel
建物が違うという事で、移動に数分から数十分かかりますよね。
全く影響がないとは言えないと思います。
インキュベーターがある部屋で細胞操作ができるのなら、細胞を溶解するところまでやってから、自分のラボに持ってきてみてはどうでしょうか。
もしくは、培養上清のELISAとか。

(無題) 削除/引用
No.4355-2 - 2015/08/21 (金) 10:05:48 - YK
mRNAの安定性を高める薬剤等を文献では入れていませんか？
インキュベータの酸素濃度はご自身で計られていますか？そうでなければ業者さんかご自身できちんと濃度を調べてみてもいいかもしれませんね。

個人的には低酸素下ではエリスロポイエチンは腎臓の細胞が作っているのだと思っていたので驚きました。

HepG2細胞での低酸素培養下erythropoietin産生 削除/引用
No.4355-1 - 2015/08/21 (金) 05:57:05 - mm
いつも大変勉強させていただいております。
HepG2細胞におけるエリスロポイエチン発現を調べる実験を始めました。HepG2細胞は、低酸素下でエリスロポイエチンを産生することが古くから文献でいわれていますので、これを再現すべく実験をおこないました。過去の報告では、１％O2下、24時間培養しますと、正常酸素下培養時にくらべ、約10〜20倍のmRNA発現上昇がおこるといわれております。
しかし、私が同様の実験をおこなったところ、ごくわずか（約2倍程度）の発現上昇しか認められませんでした。ちなみに、解析はrealtime qPCRでの結果です。
エリスロポイエチンのｑPCR primerを変えたり、また別のHepG2細胞を試したりしてみましたが、やはり顕著なエリスロポイエチンmRNA発現上昇は認められませんでした。
原因がわからず、困っております。低酸素用のincubatorが別の建物にあるのを利用しているので、回収の時には、sampleを自分のラボに歩いて持ってきて回収しているのですが、そのような短期間で遺伝子発現がかわってしまうこともないような気がしております。
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