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(無題) 削除/引用 No.4342-6 - 2015/08/17 (月) 20:37:12 - mon EGFPはホルマリン固定では消光しませんが、有機溶媒（メタノール固定やマニキュアが浸みても）で消光します。 ER-tracker（緑）と タンパク質Aに対する抗体の性質にもよりますが、有機溶媒での固定を試してみてはいかがでしょうか？もちろん、ネガコンは必須です。

(無題) 削除/引用 No.4342-5 - 2015/08/17 (月) 16:51:01 - aaa 顕微鏡でDAPIの波長がみれるなら、青のER-Trackerか二次抗体を使った方が無難。 ちゃんとコントロールをとれるなら、GFPのバックグラウンドと目的のシグナルを区別できるかもしれないけど、ソートしているだけならGFPの発現は細胞によって異なるから、定量的な解析は不可能だと思う。 そもそも、GFPの発現が目的のタンパク質を発現している細胞の指標としてみているなら、融合タンパク質なのかIRESや2Aでつなげているのかにもよるが、顕微鏡下で弱い蛍光しかみえないなら目的タンパク質も相当発現量が低いと予想されますが、それはよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4342-4 - 2015/08/17 (月) 08:26:53 - 〜 あ、FACSじゃなくて免疫染色でしたね。勘違いでした、失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.4342-3 - 2015/08/17 (月) 08:07:53 - 〜 確かSONYのアナライザーがあれば、小細工しなくてもできるんじゃないかな。バカ高いので入っているところはあまりないと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.4342-2 - 2015/08/16 (日) 07:56:02 - おお いわんとするところはわかるのですが、どうでしょう。。。 GFPとか固定などに弱いのでわざわざGFP抗体で染めることはあります。EGFPもある程度その傾向はあると思いますが、、、 いっそうのこと染色前にフォトブリーチングとかかけるとすっきりするかもしれませんが、ER-trackerはすでに入った状態ですよね、、、 生きたままでフォトブリーチングしてすぐにER-trackerでそめる?うまくいくかな?

EGFP陽性細胞を免疫細胞染色の際にFITCを使う 削除/引用 No.4342-1 - 2015/08/16 (日) 05:17:03 - ICC わかりにくいタイトルをつけてしまっていますがご容赦ください。 レンチウイルスを感染後、ソートしたEGFP陽性細胞を免疫細胞染色したいのですが、二次抗体と顕微鏡の兼ね合いのため、Alexa488-labeled 二次抗体かFITC-labeled 二次抗体を用いたいです。 具体的には、ER-tracker（緑）と タンパク質Aに対する抗体（赤）でEGFP陽性細胞を染めたいのです。ER-trackerやAlexa488-anti-Calnexinはかなり強くERを染めます。 EGFP陽性細胞を顕微鏡下で見てもあまりEGFPは強くないんですよね。細胞質にdisperseしてるからだとも思うのですが。 質問は、EGFP陽性細胞を、ER-tracker（緑）やAlexa488で染めてもいいかということです。 つまり、顕微鏡の検出感度を下げ、ER-tracker（緑）やAlexa488で染めていない細胞をネガティブコントロールとしてEGFPが目立たないまでに感度を落とす操作をしてもいいのでしょうか ？私は似たようなことをされてる方を何名か知っていますので、いいのかなと感覚的には思っています。ただ、論文となるとどうなのかなと思い、質問させていただきました。

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