BioTechnicalフォーラム [Stable empty vector]

Stable empty vector

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No.434-TOPIC - 2012/04/19 (木) 14:29:42 - TH

初歩的かもしれませんが教えてください。

Stableの系でempty vectorがゲノムDNAに挿入されていることを確かめる際、皆様どのようにされているでしょうか?
colony PCRの要領で問題ないでしょうか?
　

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No.434-7 - 2012/04/20 (金) 12:57:45 - Harmonia

同様に、目的遺伝子部分がintegrateされていても、目的遺伝子が発現するとは限りません。

(無題)

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No.434-6 - 2012/04/20 (金) 10:26:27 - ~

本当に知りたいのは、empty vectorの確認法ではないように見えますが。

>薬剤耐性があるということは、目的遺伝子の発現の有無にかかわらず薬剤遺伝子が導入されているという理解でよろしいのですかね?
導入細胞がspontaneousに薬剤耐性能を持つことは、希と考えていいと思います。それは、薬剤選択時の適切な薬剤濃度を調べる予備検討で確認されているはずです。
そのため、少なくとも薬剤耐性遺伝子（とその発現に必須の配列）は導入されていると考えていいでしょう。

>薬剤耐性でselectionしても目的遺伝子が発現していないことがあったので
Empty vectorの薬剤耐性遺伝子部分が発現していることと、目的遺伝子部分もintegrateされていることは必ずしも一致しません。

(無題)

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No.434-5 - 2012/04/20 (金) 09:35:47 - TS

薬剤耐性があれば、耐性遺伝子はIntegrateされているはずです。
でも、耐性遺伝子がintegrateされていても、目的遺伝子がIntegrateされているわけではありません。

わたしは、Empty vector controlに対しては、特にValidationを取りません（Selectionできた＝耐性遺伝子は入っている、と解釈しているため）。

nmさんの方法は、より堅実だといえるのかもしれませんね。

(無題)

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No.434-4 - 2012/04/20 (金) 09:28:30 - nnn

当方では、念のためRT-PCRで確認を行ってます。

プライマーは、発現ベクターの5'UTRと3'UTRに設計、
Empty vectorだと、短いPCR産物が（場合によっては100bpsなど）、
目的遺伝子だと、そのCDSを含んだ長さのPCR産物、となります。

(無題)

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No.434-3 - 2012/04/20 (金) 09:15:58 - TH

有難うございます。
薬剤耐性遺伝子を持つプラスミドを用いています。
薬剤耐性でselectionしても目的遺伝子が発現していないことがあったので気になってました。
薬剤耐性があるということは、目的遺伝子の発現の有無にかかわらず薬剤遺伝子が導入されているという理解でよろしいのですかね?

(無題)

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No.434-2 - 2012/04/19 (木) 14:57:05 - ~

どういう配列のempty vectorを想定されているのでしょうか？

私の場合、プロモーター付きの薬剤耐性遺伝子が含まれていて、
挿入遺伝子用のインサートが空のベクターをempty vectorと呼んでいますので、
薬剤耐性があることでベクターが入っていることを示しています。

インサート入りのベクターと同じように薬剤セレクションをかけていますので、
わざわざPCRでベクターの骨格部分や薬剤耐性遺伝子の存在を示す必要は無いと思っています。

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No.434-1 - 2012/04/19 (木) 14:29:42 - TH

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