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(無題) 削除/引用 No.4323-8 - 2015/08/09 (日) 07:32:54 - ｗｂ おおさん 御助言をありがとうございます。 週明けに、既報で用いた抗体と、今回作成した抗体を同一サンプルに用いWBの結果を比較してみます。 特異性の検討はまだですので、御指摘のとおりに、リスクのある点です。

(無題) 削除/引用 No.4323-7 - 2015/08/09 (日) 03:50:35 - おお あとは、特異性については評価ずみですか?

(無題) 削除/引用 No.4323-6 - 2015/08/08 (土) 12:08:29 - おお >[Re:5] WBさんは書きました : > 実は、私共では、他種の市販抗体（抗原認識部位は細胞内領域）を用いて、組織Ｂに対してＷＢを実施して論文報告をしています。 > > その時の結果が、”きれいなシングルバンドが、分子量から推定される大きさよりも少し小さい位置（分子量で1000ぐらいメンブレンで下にずれた位置）”でして、今回の独自抗体を組織Ａに対してＷＢを実施したときと同じバンド位置なのです。 > > そのため、最初の質問をした次第です。 困るというかというか面白そうじゃないですか。電気えいどうのシステムが違えば移動度が違うように見えることもあるので、まずはおなじゲルでながしたサンプルをtransferしたmembraneをきって二つに分けるか、reprobeして抗体による差かはっきりさせたらどうですか? それでも違うなら、市販の抗体とのエピトープぶいのが出ているので、作った抗体もペプチド抗体だからいろいろと解釈しやすいのではないでしょうか。 まずはそのペプチド配列上かその近傍に修飾される可能性のあるアミノ酸がないか確認してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4323-5 - 2015/08/08 (土) 06:57:46 - WB 皆様、貴重な御意見をありがとうございます。 おおさん >組織Aと組織Bで違いすぎるのは困ります。 =なんで困るのかよくわかりません。 実は、私共では、他種の市販抗体（抗原認識部位は細胞内領域）を用いて、組織Ｂに対してＷＢを実施して論文報告をしています。 その時の結果が、”きれいなシングルバンドが、分子量から推定される大きさよりも少し小さい位置（分子量で1000ぐらいメンブレンで下にずれた位置）”でして、今回の独自抗体を組織Ａに対してＷＢを実施したときと同じバンド位置なのです。 そのため、最初の質問をした次第です。 −−−−−−−−−−−−−−−− サンショウウオさん 糖鎖修飾があった場合、分子量の小さい方にずれるのでしょうか？糖鎖の分、大きい方にずれるのではないか、と単純に思います。細胞外領域同士がつながり分子量の小さい方にずれるとかあるのでしょうか？ もしグルコシダーゼのプロトコルの書かれた論文を御存じでしたら教えてください。、

(無題) 削除/引用 No.4323-4 - 2015/08/07 (金) 22:33:47 - おお アミノ酸分子量からの計算で出す推定値はあまり当てになりません。実際の移動度とかなり違うことがあります。そもそもマーカーも各社で移動度が違ったりします。 また組織間で移動度が違うのは修飾やalternative splicing場合によっては非常によく似た違う遺伝子の場合もあるかもしれません。 >組織Aと組織Bで違いすぎるのは困ります。 なんで困るのかよくわかりません。 その蛋白は今まで全くcharacterize されていないのですか?

(無題) 削除/引用 No.4323-3 - 2015/08/07 (金) 21:15:24 - 実験 回答ではないのですが、抗体作成に使った抗原をポジコンとして流したり、流動前に色々な処理したものを流してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4323-2 - 2015/08/07 (金) 19:37:35 - サンショウウオ あくまで可能性としてですが、組織によってGPCRへの糖鎖修飾が違ってたりするんじゃないかなと思いました。 糖鎖修飾であったばあいは、どのステップか忘れましたが、グリコシダーゼ処理をすれば糖鎖を除けます。 ただ、グリコシダーゼかなり高いです。

GPCRのウエスタンブロット 削除/引用 No.4323-1 - 2015/08/07 (金) 18:26:29 - WB よろしくお願いします。 あるGPCRのため独自にウサギ抗体を作成し、抗原に用いたペプチドを用いたアフィニティカラムで抗体を精製しました。 他ほ乳動物種の論文から発現が知られている組織Aと組織Bに対して、この精製抗体を用いたウエスタンブロットを実施したところ、次の結果が得られました。 組織A：きれいなシングルバンドが、分子量から推定される大きさよりも少し小さい位置（分子量で1000ぐらいメンブレンで下にずれた位置）に認められました。 組織B：きれいなシングルバンドが、分子量から推定される大きさよりも、かなり小さく位置（分子量で5000以上メンブレンで下にずれた位置）に認められました。 ７回膜貫通という複雑な立体構造をもつGPCRのために、ウエスタンブロットで推定分子量とおりの位置にバンドがでることは無いと思います、ですが、組織Aと組織Bで違いすぎるのは困ります。 泳動の前の、サンプルをボイルする際に添加するメルカプトエタノールの量を加減してみようかと思いますが、他に、両組織の間のバンド位置が同じになるようにする対策はないでしょうか？

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