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(無題) 削除/引用 No.4322-14 - 2015/08/09 (日) 17:22:28 - asan strata のmulti mutagenesis kitがやってることはわざわざkitを買わなくてもできるので、それを試してみて同時に何個か入れるのは手かもしれませんが、12個一度は難しいかもですね。 合成dnaを使わないなら、in-fusionとかGibson assayのようなシームレスで複数断片をつなげる方法+変異プライマーを組み合わせていけば一度に4-5つぐらいの変異は入ると思うので平行してやれば2-3回で終わると思いますね。 そうでなくても、普通にPCRプライマーを作ってつなげていってもそんなに時間はかからないと思いますし、最悪site-directed mutagenesisで普通に気長に作っていっても並行してやっていけば（2, 4, 8, 12なので3回ですから）依頼する時間と大して変わらないかもしれないですね。そんなに失敗した経験もないので、シーケンスを出してる間に先に進めればいいでしょうし。まあ、手間が多少かかるといえば手間ですけど、合間にやって1-2週間ぐらいで作れるので、そんなに手間ではない気はします。最近の酵素はそんなにエラー入りませんし、鋳型はあるのでしたらサイクル数を制御すればたぶんPCRでもなんとかならないかな？

(無題) 削除/引用 No.4322-13 - 2015/08/07 (金) 12:54:39 - おお ttp://astamuse.com/ja/published/JP/No/2013132245 こちらの図4とか、 ttp://astamuse.com/ja/published/JP/No/2010535502 こちらの図1とか、DNA断片が一部オーバーラップしていたら、PCRなどのポリメラーゼ反応でつながったDNAができます。 また、メガプライまー法ともいわれますがPCRで得られた断片をプライマーとして使いながら伸ばしていくことも行われることがあります。 (メガプライまー法はttp://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/56_36-37.pdf こちらが参考になるかな)。 両者組み合わせるなどしてうまく作業回数が減らせれば早くなるとはおもいますが、、、場合によってはトリッキーなので、、、

(無題) 削除/引用 No.4322-12 - 2015/08/07 (金) 10:49:58 - 独り言 昔、geneartを使ったときは、1500bpの配列（GC比率60％）を特に変更せずにそのまま合成できました。

合成可能性に関して 削除/引用 No.4322-11 - 2015/08/06 (木) 22:02:34 - サンショウウオ GeneartのOptimizerつかうと、 GCの含有率が平均50~60%ぐらい 発現量向上のためのコドン最適化 RNAが二次構造をとらないようにする の3点は考慮して最適化かけてくれてましたね。（最適化だけなら無料でした）

(無題) 削除/引用 No.4322-10 - 2015/08/06 (木) 19:54:11 - mutation PCRとInfusionライゲーションでできないかな。 infusionで3断片のライゲーションしかしたことがないけど。

(無題) 削除/引用 No.4322-9 - 2015/08/06 (木) 17:38:25 - 774 中年さんとほほ同意見で、 個別の変異体とその作成用のprimerがあるなら、PCRで変異を入れてけばいいのでは？ ５’末端から#1~12として、 #1変異体をベースにATG辺りのforwardと#2のreverseでPCR #3変異体をベースに#2 forwardと#4 reverseでPCR ２断片を混ぜて端っこのprimerでPCRかけたら、４変異体の出来上がり。 これを3.4個やって、混ぜてATG forward とstop reverseでPCRかけてサブクロすれば完成。 １週間もあればできそうな予感。（他人事）

(無題) 削除/引用 No.4322-8 - 2015/08/06 (木) 17:35:38 - chain 某ID○社に以前お願いした事があるのですが、合成困難性を判断してアミノ酸配列を変えずに合成しやすい塩基配列に変換することを求められました。 GC含量やリピートなどがあると「合成困難」な配列となるようです。 合成困難と判断された場合に塩基配列を変換しないといけないのですが、レアコドンやコドン頻度を考慮しないといけないので、結構面倒だった記憶があります。 他の会社はフォローしていないので、少なくともこの会社では、という情報です。

(無題) 削除/引用 No.4322-7 - 2015/08/06 (木) 17:13:05 - TS わたしも人工遺伝子に一票です。1500bpなら安いでしょう。 REサイトも付けて合成し、Ligationしたら良いでしょう。 ＞合成遺伝子の場合は、合成しやすい配列にしないといけなかったはずなので、発現に不利になることもあります。 こういうことメーカーによってはありましたでしょうか？ 発現させたい種に合わせてコドンを最適化できるというメリットはあると思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.4322-6 - 2015/08/06 (木) 17:10:50 - 独り言 お金があるなら、遺伝子合成に一票。1500bpなら８万円以下で合成できるし、１０箇所の変異どころか何十箇所でも入れ放題。 もしくは、その遺伝子を短いベクターに入れなおしてmulti-mutagenesisでいいんじゃない。 もしかしてリン酸化サイトの同定に使うとか？それならmulti-mutagenesisなら１０箇所変異だけでなく、数箇所変異も同時に取れるから、後々、サイトを絞るときにつかえるかもね。

(無題) 削除/引用 No.4322-5 - 2015/08/06 (木) 16:50:06 - chain すでに1アミノ酸変異のDNAが10個できているなら、制限酵素で切って貼ってで、できないですかね。 合成遺伝子の場合は、合成しやすい配列にしないといけなかったはずなので、発現に不利になることもあります。

(無題) 削除/引用 No.4322-4 - 2015/08/06 (木) 16:47:59 - 中年 quick change法ではなくて、PCRによって変異導入する方法を用いれば、変異導入したPCR産物を次の変異導入の鋳型として使うことで、途中でクローニングすることなしに、野生型→１アミノ酸置換変異体→２アミノ酸置換変異体→…という要領で10アミノ酸変異体を作れますが、もっと簡便な方法があるかも？

(無題) 削除/引用 No.4322-3 - 2015/08/06 (木) 16:47:57 - AP 全長合成する。 人工遺伝子合成、遺伝子合成、 gene sysnthesisなどで検索するとプロバイダはたくさん見つかるはず。

(無題) 削除/引用 No.4322-2 - 2015/08/06 (木) 16:43:01 - サンショウウオ 12点変異導入した1.5kbpのDNA断片合成して載せ替え。 もしくは断片を750bp*2に分割して外注してInfusionなど。。。 12箇所１〜２箇所ずつ変異導入→シーケンス確認　を繰り返すより、人件費、試薬費用、時間的に合成したほうが速いんじゃないかなと思います。 あと、側鎖のかたちとしては、 スレオニン→アラニン ではなく スレオニン→バリン の方が自然だと思うのですがその辺りどうなのでしょうか。

10か所の変異を同時に行うには 削除/引用 No.4322-1 - 2015/08/06 (木) 16:32:53 - mutagenesis お世話になっております。 10kbpのベクターに組み込まれた、500アミノ酸からなる蛋白質中の10個のセリン、スレオニンをアラニンに置換しようと考えております。 10個のセリン、スレオニンは、500アミノ酸中に特に近接しているわけではなく、点在しております。 1つ1つの置換は、アジレントのquickchange mutagenesis kit で行うことができました。しかしながら、12個全てを一度に置換しようとする場合はやはりひとつづつ行っていくしかないでしょうか。 アジレントにて 5つの置換を同時に行うことができるmulti mutagenesis kitがあり、そちらを使用しようかと考えたのですが、 multi mutagenesis kitは8kbpまでのベクターしか対応できないようで、断念しました。 １つ１つ置換、精製、シーケンス確認以外で、何か方法があれば、教えていただけましたら幸いです。 宜しくお願い致します。

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