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(無題) 削除/引用 No.4320-6 - 2015/08/09 (日) 17:31:06 - asan NHEJで修復される場合であっても、基本的にはerror-proneなだけであってマイクロホモロジーとか癖が無ければちゃんと修復される確率は結構高いと思われます。 一番考えられるのは、生存に重要だったり、ディスアドバンテージがあるんじゃなあいかなという点ですね。 そうでないにせよ、タンパクのノックアウトを作りたいなら抗体での検出は必要かもしれないので、抗体でスクリーニングしてKOされてると思われるものを探す方が手っ取り早いかもですね。抗体ないならしょうがないですが、この場合ヘテロでも単なる数アミノ酸の欠損等になってることも結構ありますので注意です。この場合は、ターゲット配列を変える必要があるかもです。 gfpでソーティングしてるならば、gfpの発現ができるだけ高い分画のみを取った方が効率は上がるみたいです。off-targetをあまり気にしないならば。

(無題) 削除/引用 No.4320-5 - 2015/08/06 (木) 14:45:21 - AP >切断されたからといって変異が導入されずに元に戻ることもありえませんか？ 二重鎖切断の多くは相同組換え修復で元通りになると考えられます。 培養細胞のような細胞周期が動いている細胞ではそうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4320-4 - 2015/08/06 (木) 14:26:58 - kk >[Re:3] くりすぱーさんは書きました : > GFP陽性をソートしてクローニングしたからといって、全てがgenome edittingされるというわけではないんでしょうか。 GFP陽性細胞はプラスミドが導入された細胞というだけであって、ゲノムが切断された細胞というわけではないし、切断されたからといって変異が導入されずに元に戻ることもありえませんか？

(無題) 削除/引用 No.4320-3 - 2015/08/06 (木) 14:03:59 - くりすぱー APさんありがとうございます！ その可能性は高いんですよね。global KOマウスは胎生致死で、conditionalに組織特異的KOでは出生後すぐに死亡したり、なんともなかったりして組織ごとのその遺伝子の重要性は異なるようです。 ヘテロばかりが取れてしまうのは仕方のないことかもしれませんが、オリジナルのゲノム（ゲノム編集を受けていない）を持つ細胞もかなりの数取れてきていることにも驚いています。 GFP陽性をソートしてクローニングしたからといって、全てがgenome edittingされるというわけではないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4320-2 - 2015/08/06 (木) 13:46:14 - AP 細胞の生存、増殖に必須の遺伝子なんじゃないですか

ヘテロしか取れません。 削除/引用 No.4320-1 - 2015/08/06 (木) 12:53:01 - くりすぱー pX458を使って、ノックアウト細胞の作成に挑戦しています。 出来てきたコロニーのタイピングをすると、GFP陽性細胞をソートしたにもかかわらず、約半分がオリジナルのゲノムと同じで、残り半分がヘテロでした。 ホモのアリルに変異を持つクローンが欲しいのですが、これほど確率は低いのでしょうか？ クリスパープラスミドは一種類しかありません。

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