Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

マウスFlt3L-BMDCの培養実験について トピック削除
No.4319-TOPIC - 2015/08/06 (木) 10:17:31 - 初心者
いつもお世話になっております。

現在マウスのFlt3-BMDCを用いた実験を行っております。
BMDCの培養は、マウス骨髄細胞浮遊液を作製し、24well plateにて4x10^6cells/1ml/well で播き、100ng/mLのHuman Flt3-Ligand入りRPMI（10%FBS+50uMβ-ME）で10日間培養後、接着している細胞をFlt3-BMDCとしています。
その細胞を用いて各種刺激物質による刺激実験を行っています。

FACSをかけたいのですが、細胞数が少なくて１回の培養であまり取れなくて困っております。
もしかして浮遊しているのも使用できるのでは？と思ったのですが、周りで分かる者がいないため、ここに質問させていただきました。

1)浮遊細胞もFlt3-BMDCになっているのか？

2)Flt3-BMDCはCD11cとCD11bとCD8aの樹状細胞マーカーのどれが陽性になるのか？

以上２点についてご教授いただけないでしょうか。
宜しくお願い致します。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.4319-7 - 2015/08/07 (金) 07:49:25 - a
> この誘導だとCD11c+ CD11b- CD8a-のpDCは取れますでしょうか？
回収可能だとは思いますが、調べたことがないので分かりません。pDCはCD11cをあまり発現していないので、CD11c+よりもCD11c int/lo画分でゲートをかけた方が良いと思います。CD11c発現が高いDCはミエロイド系DCです。

> あと、８日後の非接着性細胞は未成熟な樹状細胞と分かったのですが、接着している細胞も樹状細胞（成熟した）という認識でよろしいでしょうか？
刺激前の話ですか？それでしたら成熟化による接着ではありません。確かに骨髄回収時点で成熟したpDCや他の骨髄細胞との相互作用する過程で接着しているpDCもいるとは思いますが、全てが成熟化DCでは無いですし、ストローマ細胞などDC以外の細胞も多く含まれています。答えになっていなかったら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用
No.4319-6 - 2015/08/07 (金) 00:09:28 - alpha
alpha様、おお様
→ありがとうございます。a様のアドバイスで解決に至りそうです。

a様
→アドバイスありがとうございます。
そうです。pDCが欲しいのです。
この誘導だとCD11c+ CD11b- CD8a-のpDCは取れますでしょうか？

あと、８日後の非接着性細胞は未成熟な樹状細胞と分かったのですが、接着している細胞も樹状細胞（成熟した）という認識でよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.4319-5 - 2015/08/06 (木) 23:51:16 - TK-1
> 1)浮遊細胞もFlt3-BMDCになっているのか？
はい。

>
> 2)Flt3-BMDCはCD11cとCD11bとCD8aの樹状細胞マーカーのどれが陽性になるのか？
CD11c, CD11bはでますが、CD8aはそれほどはっきりしないかほとんど出ません。ですので、
CD4+ DC: CD45+ CD11c+ CD11b+
CD8+ DC: CD45+ CD11c+ CD24+
pDC: CD45RA+ CD11c+ SiglecH+

という感じで見れるはずです。

(無題) 削除/引用
No.4319-4 - 2015/08/06 (木) 19:58:52 - a
要はpDCがほしいということですよね？
以下が私の誘導方法なので参考になれば幸いです。
pDCはFLt3Lに加えて、IL-４ (50 ng/mL) を用いた方が効率よく誘導出来ます。おそらくこの組み合わせが一般的です。またその細胞密度でしたら６ウェルの方が良いと思います。培地３mLくらいでしょうか。２日おきに５０％の培地を捨て、等量の培地 (各種サイトカイン) を添加して計８日間培養します。pDCに限らず未成熟な樹状細胞は非接着性なので、ウェルを軽く揺すり浮遊している細胞をpDCとしています。これにアジュバント刺激を加えれば、pDCは成熟化して接着性を有します。pDCのフェノタイプですが、論文により違いがあるものの私は、CD11c int(-) CD11b+ B220+ 画分をpDCとみなしています。また、CD8αは基本的にミエロイド系DCなので調べる必要はないと思います。

(無題) 削除/引用
No.4319-3 - 2015/08/06 (木) 14:01:00 - おお
よくわからないですが正常の細胞でいいなら、ラットとか大きい動物を使えばどうでしょう。

浮遊している細胞は10日間培養後、接着している細胞をFlt3-BMDCとしていますという定義に当てはまらないですが、もと文献とかではどうかいてますか?その誘導方法を発案した論文ならその辺は情報があるんじゃないかとおもえるのですが、、、referencesを示すのも手かもしれませんよ。

(無題) 削除/引用
No.4319-2 - 2015/08/06 (木) 13:31:36 - alpha
私もあまり詳しくないのですが、その浮遊細胞は死んでいるから浮遊しているのか、immatureな状態だから浮遊しているのか、どちらでしょうか。
あるいは、Flt3-BMDCはFlt3の刺激でmatureな状態になるでしょうか？
この辺りがはっきりしているのであれば、初心者様のご質問に回答に繋がりますでしょうか？

マウスFlt3L-BMDCの培養実験について 削除/引用
No.4319-1 - 2015/08/06 (木) 10:17:31 - 初心者
いつもお世話になっております。

現在マウスのFlt3-BMDCを用いた実験を行っております。
BMDCの培養は、マウス骨髄細胞浮遊液を作製し、24well plateにて4x10^6cells/1ml/well で播き、100ng/mLのHuman Flt3-Ligand入りRPMI（10%FBS+50uMβ-ME）で10日間培養後、接着している細胞をFlt3-BMDCとしています。
その細胞を用いて各種刺激物質による刺激実験を行っています。

FACSをかけたいのですが、細胞数が少なくて１回の培養であまり取れなくて困っております。
もしかして浮遊しているのも使用できるのでは？と思ったのですが、周りで分かる者がいないため、ここに質問させていただきました。

1)浮遊細胞もFlt3-BMDCになっているのか？

2)Flt3-BMDCはCD11cとCD11bとCD8aの樹状細胞マーカーのどれが陽性になるのか？

以上２点についてご教授いただけないでしょうか。
宜しくお願い致します。
全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。