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(無題) 削除/引用 No.4318-6 - 2015/08/06 (木) 12:05:20 - AP >プライマーの中心部分の変異なので、エキソだったら問題ないかなぁとも思うのですが。。 そのとおりです。問題になるのは3'端のミスマッチです。 余談ですが、 最近の酵素はいわゆるHot Start(HS)versionという、pol活性、exo活性を抗体などでブロックしてあってサーマルリサイクルで変性温度にさらされて始めて活性がでるようになっているのが多くなってきました。HSでない酵素の場合、反応液を混ぜてる間にも酵素が働いて3' exo活性でプライマーを削ってしまい、特異性が下がったり増幅が悪くなったりすることがあるので、反応液調製の手順に気を使ったのもです。

(無題) 削除/引用 No.4318-5 - 2015/08/06 (木) 11:01:13 - mon 25-30merくらいで中心部に変異をいれたprimerで、KODplus ver1を（未だに）使っていますが、問題ないです。変異部位が1bpなら3'端から10bpくらい離れていればOKなようです（鋳型量、酵素の種類によるとは思いますが）。 なお、3'側の3base以内に変異(degenerate seq)があると変異が入らないものも取れてきます（増幅効率も悪い）。

(無題) 削除/引用 No.4318-4 - 2015/08/06 (木) 10:06:22 - 誠 目的はポイントミューテーションです。

(無題) 削除/引用 No.4318-3 - 2015/08/05 (水) 21:13:44 - おお もくてきはなにかなぁ。。。かかるかどうかという点では大丈夫だけどなぁ。

(無題) 削除/引用 No.4318-2 - 2015/08/05 (水) 14:06:50 - QC よく原理を理解すれば、答えはわかるはずです。 QuikChangeと同じ方法であれば、むしろTaqを使ってはいけません。

ミスマッチプライマーを使う際のポリメラーゼ 削除/引用 No.4318-1 - 2015/08/05 (水) 13:24:22 - 誠 いつもお世話になっております。 鋳型に変異を導入するために、配列の中心部分にミスマッチ塩基を１つ入れたプライマーを使っているのですが、その際に使用するポリメラーゼに３→５エキソ活性があるものは問題なく使えるのでしょうか？ ネットサーフしていた所、ミスマッチプライマーをつかったPCRに、３→５エキソ活性をもつポリメラーゼは向かない、という記述を目にしたもので。。。 プライマーの中心部分の変異なので、エキソだったら問題ないかなぁとも思うのですが。。 どなたか知恵をお貸しください。お願い致します。 ちなみに、普段はTaq使ってます。

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