genotyping PCRを行っています。
が、PCRを40サイクル回してようやくUV照射で目に見えるband（一応目的の一本のみ）がでます。
Primer pairは共同研究者から渡されたもので、その研究室はゲノムのスペシャリスト集団ですので、Primerというよりは自分の手技が問題かもです…
PCR反応regularなTaq polを使って、94度, 3分、（94度, 20秒、50度, 20秒、72度, 35秒）で453 bpを増やしています。
アニール温度が低いと思いますが、60度、58度等で行うとPCRはかかりませんでした。
温度を下げ、ようやくこの温度でbandが再現性よく見られました。
genomic DNAサンプルは、 24 well dishの1 wellの細胞の1/2の培養細胞から調整しています。
方法としては、SDS-プロテネースK法で55度, 2時間処理したものです。（プロテネースKは95度, 10 minで死活化済み）
その後、フェノクロ、エタチンで精製したものを使用しました。
熱失活させたプロテネース処理サンプルから直接PCRを試みましたが、bandは出ずでした。
また、PCR反応の鋳型を1/5ずつ振って減らしてみましたが、50 ulのPCRスケールで原液1 ulを使ったときにだけbandはでました。それ以上減らすとbandはでませんでした。DNAの鋳型を増やすことは行っていません。
プロテネースK法で処理後のサンプルはvoltexしてませんし、エタチンしてTEで溶解したサンプルもvoltexしてません。以前に、voltexしてgenomeを剪断した場合としない場合とでPCRを比較してみましたが、大差ありませんでしたので、voltexはしていません。
Taq polの他にPfuも使いましたが、結果は変わらずでした。
40サイクル回して、ようやくbandがでてくるようでは、やはりPCR条件がおかしいと考えていいでしょうか？共同研究者に条件を聞くのが早いのですが、これくらいは自分でクリアしたいと思っていましたが、恥ずかしながらちょっと時間がかかり過ぎています。
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