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(無題) 削除/引用 No.4301-8 - 2015/08/04 (火) 22:47:07 - 効率チェック >[Re:7] おおさんは書きました : > 大きさについても検討されていましたのでてにいれるなら、いいかと思います。 > > high copyのプラスミドとpBR322の比較でほとんど変わっていない印象でした。大きさについてもpBR322のレンジではそんなに効率が落ちてないようです。20kbpのあたりくらいだったかな落ちてくるのは。 > レスありがとうございます。ありがとうございます。やはり、基本的な条件であれば重量あたりのコロニー形成数は共通の指標になりそうですね。

(無題) 削除/引用 No.4301-7 - 2015/07/31 (金) 11:55:01 - おお 大きさについても検討されていましたのでてにいれるなら、いいかと思います。 high copyのプラスミドとpBR322の比較でほとんど変わっていない印象でした。大きさについてもpBR322のレンジではそんなに効率が落ちてないようです。20kbpのあたりくらいだったかな落ちてくるのは。

(無題) 削除/引用 No.4301-6 - 2015/07/31 (金) 10:01:34 - 効率チェック mon様 おお様 コメントありがとうございます。お礼が遅くなり申し訳ありません。 mon様 詳細に教えてくださってありがとうございます。 東洋紡準拠と書きましたが、1pgのDNAを使うということだけでSOCにもプレートにもクロラムフェニコールは培地へ添加しませんでした。コロニー形成に影響があり効率チェックとして成立していなかった可能性もある訳ですね。それでも、差としては3倍がいいところというのは分かってよかったです。 おお様 リンク先の論文が残念ながら落とせませんでした。機会を見つけて入手しようと思います。おっしゃる通り、分子数としては2倍差もないですが大きさによる効率による差もあるので、その影響もあるかと考えスッキリしないものがありました。ただ、一番分かりやすい説明は1pg/ulのストック濃度が低すぎるために、保管の間に壊れたか、作業の途中でプラスチックに吸着してしまったのではないかと考えています。 まとめると、ラボ内で統一して実施する効率チェックは性能の比較に用いる事ができる。他のラボや購入したコンピテントせるについてもpUC19とpBR322では数倍の差にすぎない。手技が安定した人間が行った効率チェックは研究室間でも、十分に参考にはなるというところでしょうか。 一旦、解決にさせていただきますが、また何か情報がありましたら教示いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4301-5 - 2015/07/30 (木) 06:55:06 - おお プラスミドの長さで単純計算して質量からコピー数に変換してもお示しのプラスミド間では2倍程度違うぐらいですよね。

(無題) 削除/引用 No.4301-4 - 2015/07/30 (木) 06:51:22 - おお 4283のとぴにリンク張ったやつにかいてあるよ。もういちどはっとくけど。 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283683802848

(無題) 削除/引用 No.4301-3 - 2015/07/30 (木) 06:42:34 - mon pUCのori+1 point mutation +copy数抑制遺伝子rop =pBR322のoriです。歴史はpBR322が古いです。pBlueScript系のoriはpBR322のori without ocopy数抑制遺伝子ropらしいです。 経験的に遺伝子導入効率（コロニー数で判定）はpUC（1.5-3倍かな）＞pBR322です。 pBR322はクロラムフェニコール添加でコピー数が増えます。通常25-50copies/cells−＞200copies/cells（私は30℃培養で定常期になった状態に同量の新規培地＋0.5%Glucose+クロラムフェニコールを添加し、3-6時間37℃で培養し菌体を回収します） pUCでは、20-25copies@25℃、100~500copies@37℃, ~1000copies ＠42℃(３hr以上の長時間培養は推奨されない）と言われています。 もっとも、バッフルフラスコ（液量は容量の約1/7)を使うと菌体数が2-4増えるのでこちらが手っ取り早いです。

(無題) 削除/引用 No.4301-2 - 2015/07/30 (木) 01:22:59 - 効率チェック 自分で調べて気がついたのですが、pBR322ってlow copyなんですね。オリジンがpUC19と同じだったので、high copyだと思い込んでいました。

コンピテントセル効率チェックに使うプラスミドの選択について 削除/引用 No.4301-1 - 2015/07/30 (木) 00:43:11 - 効率チェック ここのところこちらのフォーラムを拝見していて、コンピテントセルの効率を意識せずに実験をやっている（最近実験を始めたであろう）人の投稿をよくみます。それ自体は別に私にはどうでもいいのですが、実は自分自身、コンピテントセルの効率として提示される数字に如何わしいものを感じています。そこで、以前、自分が体験したことから質問させてください。 ある研究室でコンピテントセルの作成を立ち上げました。TOYOBOコンピに同梱の1pg/ulに調整済みのpBR322を1ul使用して効率チェックしたところ10^5程度しか効率が出ませんでした（TOYOBO準拠）。ただ、pBR322の濃度が薄いために、品質をチェックする方法が無く、同じロットのコンピテントセルを使って別途pUC19を1ng使用してチェックしたところ、10^7以上の効率が出ました（別会社準拠）。 作成したコンピテントセルは日常の使用に堪えるものだったので、以降pUC19で測定することにしました。ただ、pBR322が4361bpでpUC19が2636bpであるため、長さや分子数からpUC19の方が効率が高くなると考える根拠があったので、ちょっとごまかしめいた物を感じてしまいました。突き詰めなかったので気持ち悪さが残っているのが、果たしてプラスミドの種類の責任であったのか、あるいは自分の手技やインプットのDNA量や標準として用いたプラスミド溶液に問題があったのか未だに分からないということです。 そこで皆様に質問なのですが、コンピテントセルの効率チェックに用いるプラスミドや方法を変更することにより、ug当たりの"数値"が大幅に変わる、あるいは大差がないという経験があれば教えていただけないでしょうか。

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