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(無題) 削除/引用 No.4299-5 - 2015/07/30 (木) 10:52:10 - pp 私はKOマウスをCRISPR/Cas9で作ったときのgenotypingは おおさんの方法で目星をつけました。 変異が予測される部分を中心に両側200bpくらいをKODなんかで増幅して ゲル切り出し精製後、PCRで使ったのとは別のちょっと内側のprimerで sequencingしました。 変異が入っている場合はある点から波形がずれて重なるのですぐわかります。 たまに両アリルにmutationが入ることもありますが、変異が入ったかどうかは 判別できます。 私の場合30個体からこの方法で5個体程度に絞り、クローニングし配列を決定しましたよ。

(無題) 削除/引用 No.4299-4 - 2015/07/28 (火) 22:03:37 - おお あるいは直接よんで目星をつけてからそのクローンでTAをするとか。

(無題) 削除/引用 No.4299-3 - 2015/07/28 (火) 22:01:36 - おお ゲノムから直接読んでも破壊されているかどうかはわかるかと思います。途中から2種類の波形が重なるので従来の配列からできる波形を無視しながら読んでいくとどの様に破壊されたかわかるのではないかとおもいますがいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4299-2 - 2015/07/28 (火) 21:14:46 - 7744 > そこでお聞きしたいのが、TAクローニングせず、ざっくりシングルコロニーからgenomeを取ってきて、PCRしてdirect sequenceでもなんとか読める（KOかどうかの判別）んでは？と思うのですが、うまくいくでしょうか？ その方が一般的でしょう。

CRISPRでKO細胞を作る際のgenotypingの仕方 削除/引用 No.4299-1 - 2015/07/28 (火) 15:36:44 - CC9 今、初めてCRISPR-Cas9を利用した遺伝子 KO細胞の作製を試みています。 タンパク質に対する抗体がないので、pX458を遺伝子導入し、GFP陽性細胞をクローニングしたシングルクローン細胞からgenotypingでKO細胞を探そうとしています。 ただ10, 20個もシングルコロニーを拾ってPCRしてTAクローニングだと大変だなと思っています。 そこでお聞きしたいのが、TAクローニングせず、ざっくりシングルコロニーからgenomeを取ってきて、PCRしてdirect sequenceでもなんとか読める（KOかどうかの判別）んでは？と思うのですが、うまくいくでしょうか？ paternalとmaternal alleleでは変異の仕方は同一ではないとは思いますが、実際のシークエンスの波形からなんとかpaternalとmaternalの波形がわかって、それでKOかどうかわかるのではと思っています。どうでしょうか？皆様のご意見をうかがわせてください。

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