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(無題) 削除/引用 No.4298-15 - 2015/07/29 (水) 08:37:30 - taniguchi >いまだに最初の酵素が不安定という最初の話がみえませんが、、、要するに量が少ないし、活性もcharacterizeがあまりされていない酵素で比較するものがないし、弱いような気がするけどよくわからないということですか? うまく説明できなくてすいません。いままさにその状態です。 アフィニティー→そこから更に展開することも考えています。やはりそれを試すのが良いのかもしれないですね、ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.4298-14 - 2015/07/29 (水) 01:10:18 - おお >陰イオン交換クロマトグラフィーまでは、 ん、陰イオン交換でロスがあるってことですかね。。。たとえば見ているバンドが同じサイズでもノンスペがかぶって電気えいどうでしっかり見えてたけどイオン交換後ノンスペが除かれたのでバンドがかなり薄くなったとかないでしょうか? 抗体や活性での評価が必要かもしれません。 もしイオン交換カラムでロスがあるなら、うーんバッファーを工夫するか支持体の違うカラム(イオン交換でもいいし違う性質のカラムでもいいとおもう)にするか、、、

(無題) 削除/引用 No.4298-13 - 2015/07/29 (水) 01:03:02 - おお 量が少ないということなので、発現系、発現条件、抽出方法なども検討の余地があるかもしれませんね。硫安をかましているということは、分泌させているのかなともおもえますけど、そうすると培地成分でも精製度がかわるかもしれません。 量に関しては力ずくで大量の培養、または数回の培養を一緒にしてまずはHisなどのアフィニティーで粗精製してしまう手もあるかもしれません。 いまだに最初の酵素が不安定という最初の話がみえませんが、、、要するに量が少ないし、活性もcharacterizeがあまりされていない酵素で比較するものがないし、弱いような気がするけどよくわからないということですか?

(無題) 削除/引用 No.4298-12 - 2015/07/28 (火) 21:28:25 - おお 今樹立している系に加えて特異的なアフィニティーカラムをかますといいんじゃないでしょうかね。 初段階のロスが大きいならアフィニティーカラムを初めに持ってくると有効な場合もあります。なので6xHisのタグで最初のステップで回収しておき、すでに条件がわかっているイオン交換でさらに精製すればいいかもしれません。 もちろん今の系にさらにNiカラムを加えてもいいかとは思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.4298-11 - 2015/07/28 (火) 20:02:59 - his 大腸菌組換えタンパクなら、タグ付けてみるのはいいかも。 KBrで検索するとfibronectinしか出てこなかった

(無題) 削除/引用 No.4298-10 - 2015/07/28 (火) 16:42:42 - seisei 本当にKBrを溶出に用いているのですか。

(無題) 削除/引用 No.4298-9 - 2015/07/28 (火) 16:16:19 - Taniguchi たくさんのご助言ありがとうございます。 �@すいません扱ってる合成酵素は事情により伏せています。 �A現在、カラムで分けた後、0.177 mg/ml程度のタンパクしか採れておらず、加えて夾雑物が混ざっている状況であり、そもそもこの酵素の活性が低いのかもわかっていない状態です。 もう1step精製したいところなのですが、目的のタンパク量が少なく、次にいけないので困っていました。 �B大腸菌組換えタンパクを使用しています。 �C硫安分画の濃度条件の検討・Bufferの補酵素等の検討は行いました。 電気泳動で精製過程ごとに確認しているだけなので、タンパク量を測定した具体的な収率は出していないのですが、陰イオン交換クロマトグラフィーまでは、しっかり上清に目的のタンパクがきています。0.1〜0.8M KBrをカラムに流しています。

(無題) 削除/引用 No.4298-8 - 2015/07/28 (火) 15:14:10 - mon 大腸菌？酵母？培養細胞？　菌体(細胞）内？分泌(ペリプラズム？培養上清）？など出発材料によって対応は異なります。 マイルドな溶出が可能なCalmodulin結合tagや大腸菌ペリプラズムでビオチン化されるAviTag（+Mutein-beads)、使用目的によってはやや大きいタグですがHalo-TagやSNAP-tagも検討してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4298-7 - 2015/07/28 (火) 14:53:46 - おお >[Re:6] たていすさんは書きました : > それぞれの分画の酵素活性の収率はどうなっているのか? 私もそこをききたいところなんですが、"扱っている酵素が非常に不安定で"というフレーズに意味するところがよくわからないので、そこをまずははっきりして欲しいと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.4298-6 - 2015/07/28 (火) 14:17:25 - たていす ＞私の扱っている酵素が非常に不安定で、 が、そもそも誤解で、「酵素活性測定条件が非常に不安定」であるのかもしれない。精製するにしたがって、必須の成分が抜けている可能性もあるだろうしね。 30%硫安分画とは、30%飽和硫安の沈殿なのか、上清なのか？ 30%沈殿であれば20%でカットできるのか、もしくは、30%上清であれば50%で沈殿できるのか？ それぞれの分画の酵素活性の収率はどうなっているのか? と言ったことで、いくらか改善できるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4298-5 - 2015/07/28 (火) 14:01:18 - おお 酵素の名前を開示できますか?同様の酵素を精製したりしているreferencesは探しましたか?

(無題) 削除/引用 No.4298-4 - 2015/07/28 (火) 13:45:58 - seisei 用いるBufferによる安定化の検討はされているのでしょうか？ グリセロール，補酵素があれば補酵素や競合阻害剤の添加，還元剤の添加など。

(無題) 削除/引用 No.4298-3 - 2015/07/28 (火) 11:42:44 - NM 雑多なものとはなんでしょう？夾雑物？ Hisタグを付けることでより不安定になることもありますが、粗精製をワンステップかつ短時間にすることで夾雑プロテアーゼによる分解を減らすことができると思います。 また、不安定の要因がイオン強度（高すぎるor低すぎる）であれば、硫安分画やイオン交換に比べてHisタグ精製は塩濃度の変化がすくないので、安定に得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4298-2 - 2015/07/28 (火) 11:21:31 - おお 不安定っていうけど活性が不安定なの?それとも蛋白が分解されるということなの? Hisの方は透析などかまさないので比較的早く取れるかもしれませんけど、特に発現量が低いときは夾雑物が多いかと思います。 場合によってはGSTなんかでもいいかもしれません。

合成酵素の精製 削除/引用 No.4298-1 - 2015/07/28 (火) 11:03:02 - Taniguchi こんにちは。初の投稿です。 今回質問させていただきたいのは、合成酵素の精製に関してなのですが、 30%硫安分画→透析→陰イオンクロマト(step-wise)で、SDS-PAGEで目的のフラクションを探索する方法をとっていたのですが、 私の扱っている酵素が非常に不安定で、単離精製するのが非常に難しい状態です。 そこで、方法をガラッと変えてヒスタグに一発でとろうと考えたのですが、雑多なものや構造変化による失活などで綺麗にとるのは厳しい方法でしょうか？ アドバイスお願いします。

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