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(無題) 削除/引用 No.4288-33 - 2015/07/23 (木) 14:42:06 - ぺーぺー 返信ありがとうございます。 私もやはり、最初のクローンが予測と違うとか、設計に誤りがあったとかが疑わしいと思います。シークエンスの結果があるのであれば、手を動かす前にそのデータをしっかり解釈することをお勧めします。特に生データでEcoRIとSalIが予想通り（欠いてもいないし、考えていないところに存在もしない）事を確認することが肝要かと思います。そのためのソフトウェアが無ければApE(A plasmid Editor)が最低限の機能しかありませんが、使いやすいと思います。 色々、混乱されてると思いますし、一度落ち着いて消化されると良いかと思います。このレスに返信は不要です

(無題) 削除/引用 No.4288-32 - 2015/07/23 (木) 14:28:26 - tora お答えするのを忘れていました。 pGEMに入れる段階ではTAクローニングで行いました。 ペーペーさんや他の方もおっしゃっているように、制限酵素でのインサートの切り出しがうまくいっていない可能性があるので、今度はPCRで増幅したインサートを、制限酵素処理してライゲーション、形質転換をやっていこうと考えています。

(無題) 削除/引用 No.4288-31 - 2015/07/23 (木) 14:21:47 - ぺーぺー TAクローニングかどうかだけ教えてください。気になるから。

(無題) 削除/引用 No.4288-30 - 2015/07/23 (木) 14:19:48 - tora 皆さん様様なご意見ありがとうございます。 とりあえずいくつか工夫してやっていこうと思います。 結果についてはまた報告しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4288-29 - 2015/07/23 (木) 14:15:41 - ぺーぺー 私はpGEM-TベクターをTAクローニングでしか使った事がないので詳しくないのですが、クローニングというのはTAクローニングのことですか？ おおさんが指摘されているように、付加した配列のエラーでトラブルがおきる可能性があります。例えばですが付加したSalIとベクター側のSalIが、インサートの両端に位置しており、EcoRIで消化されなくても目的の大きさのバンドが出現してろくにインサートにならなかった……とか。それでも、一個もコロニーが出ないのは、直感的に不自然ですが。

(無題) 削除/引用 No.4288-28 - 2015/07/23 (木) 14:05:04 - ぺーぺー いろいろアドバイスがありますが、片っ端から手をつける前に出来るだけ問題を切り分けた方が良いと思いますよ。 ところで、ちょっと思ったことがあります。シークエンスが二度手間になるかもですが、最初にPCR産物をインサートにライゲーションして同じ制限酵素で切り出してインサートにするのであれば、最初のクローニングにつかったインサートを直接使ってみるのもひとつかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.4288-27 - 2015/07/23 (木) 03:05:12 - おお >pGEM T-easyベクターにクローニングするところまでは完了しました。 できたプラスミドの配列は読んでみましたか?ちょうどジャンクションにアクシデンタルにサイトができてたりして。

(無題) 削除/引用 No.4288-26 - 2015/07/23 (木) 00:30:18 - tora APさん UV被曝については工夫してやってみようと思います。ご意見ありがとうございました。 monさん ご意見ありがとうございます。 培養条件についても検討していきたいと思います。 おおさん インサートDNAの関係でEcoR IとSal Iを使っていましたが、別の制限酵素についても考えてみようと思います。ご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4288-25 - 2015/07/22 (水) 22:50:24 - おお EcoRI/SalI でしか挿入できないの? なんだかわからないけど入らないということはたまにあって、違う酵素の組み合わせとかPlan B的なものも用意しておくといいことがある。場合によっては、挿入してからフレーム合わせのために一か所制限酵素で切ってクレノーなどでfill inしてself ligationさせたりとか。EcoRIより外側の酵素を使っていれておいて、出来上がったものからEcoRIで余分なものを抜くとか。

(無題) 削除/引用 No.4288-24 - 2015/07/22 (水) 21:29:23 - mon pGEM T-easyベクターへのクローン化は成功しているので、サブクローニングの手技というより、目的タンパクの漏洩発現が大腸菌に毒なのかもしれませんね。 もし、これが原因なら、1% Glucose入り寒天培地を使う、室温(18~25℃)で培養する、菌株を変える等で、コロニーが取れるかも。

(無題) 削除/引用 No.4288-23 - 2015/07/22 (水) 20:27:53 - AP 全く当てないようにしろというのが私の意見です。 照射量に応じて効率はどんどん下がります。短時間でも、長波長UVでも、影響はゼロではありません。チョー楽勝でコロニーが何千もでるような実験であれば、UVによって一桁、二桁効率が落ちても、あたりのコロニーが一個も拾えないということはないでしょう。でも、そうじゃないことのほうが多いので、わざわざ効率を落とすようなことは最初からするべきじゃありません。 UVでバンド位置を観察するレーンと切り出し用のレーンを分けて、切り離すとかアルミフォイルで覆うとかして、切り出し用のレーンにはUVを全く当てない。ナイフでバンド位置の印だけつけて、実際の切り出しは普通の照明下で行なう、など。過去ログに多くのディスカッションがあります。

(無題) 削除/引用 No.4288-22 - 2015/07/22 (水) 19:27:43 - tora APさん ご意見ありがとうございます。 UV被曝についてですが、どのくらいの時間であれば問題ないのでしょうか。自分ではなるべく早く回収しているつもりですが（だいたい20秒以内）、今まで時間を測って行ったことがないので、経験則的なものがあればお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4288-21 - 2015/07/22 (水) 19:12:15 - AP >インサート、ベクターともに上記の制限酵素で37℃、1時間反応させ、電気泳動しバンドを回収しています >現状では全くコロニーが生えてこないので、 コンストラクションがうまくいっていなくても、全く生えないということはなかなかないんですがね。プラスミドの切れ残りのコンタミとか、片方しか切れなかったプラスミドのセルフライゲーションとかでどうしてもバックグラウンドがはでるので。そういう場合に可能性の高い原因の第一はUV被爆です。

(無題) 削除/引用 No.4288-20 - 2015/07/22 (水) 18:51:17 - tora daiさん ご意見ありがとうございます。 今ある材料でなるべくお金をかけずに行いたいので、とりあえずは現在の方法で工夫しつつやっていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.4288-19 - 2015/07/22 (水) 18:35:54 - doi in-fusionを使いなさい

(無題) 削除/引用 No.4288-18 - 2015/07/22 (水) 18:32:25 - tora seventhさん ご意見ありがとうございます。 おっしゃる通り制限酵素の認識部位はかなり近いですが、もし片方の制限酵素でしか切断できていなければ、セルフライゲーションが起こり、少なからずコロニーは生えてくるものだと考えています。現状では全くコロニーが生えてこないので、セルフライゲーションは起こっていないと考えていて、ベクターは切断できていると思います。私の解釈に間違いなどあればご指摘お願いします。

(無題) 削除/引用 No.4288-17 - 2015/07/22 (水) 18:27:20 - seventh pGEX-6P-1が生のベクターなら認識部位が近すぎて同時切断できないような気がするのですが、そのへんは確認していますか？

(無題) 削除/引用 No.4288-16 - 2015/07/22 (水) 18:26:42 - tora 小言幸兵衛さん ご意見ありがとうございます。 ポジコン、no cutのプラスミドともに、十分なコロニー数があるので、コンピテントセルの形質転換効率は問題ないと考えています。ポジコンについてはpGEM t-easy キットに付属しているポジコン用のインサートとベクターをもちいて、形質転換を行い、200個ほどのコロニーが得られています。キットの説明書にもこれくらいのコロニーが出来ると書いてあるので問題ないと思います。空ベクターについても数え切れないほどのコロニーが出来ており問題ないはずです。

(無題) 削除/引用 No.4288-15 - 2015/07/22 (水) 18:08:13 - 小言幸兵衛 皆さんの質問に対する返答に清々しいほど定量性に関する情報が欠けているのですが、単なる効率不足である可能性は否定できるのでしょうか。 ポジコンなるものが、one-cutプラスミドの再環状化なら、EcoRI-SalI同士のライゲーションよりはかなり効率が良いはずです。no cutのプラスミドならなおのこと。 これらのポジコンを形質転換したものは、totalの形質転換体の数はどのくらいですか？「ポジコンや空ベクターでコロニーが形成されているので」とお書きになっていますが、この数が10〜100程度ならあまりに効率が低すぎる。10^8/ugのコンピテントセルを10ngのプラスミドで形質転換したら、100万かそれに準じる数の形質転換体が出てるはずですが、そうなっていますか？

セルスクレーパーでコンラージ棒の代用 削除/引用 No.4288-14 - 2015/07/22 (水) 17:50:17 - tora ペーペーさん コンピテントセルの形質転換効率は1.0×10の8乗です。 たていすさん ポジコンではligaseに問題がないことを確認しています。 制限酵素サイトについてですが、確かにプライマーに付加してあります。 おっしゃる通りEcoR Iでしか切断できていないのかもしれません。 プラスミドから切り出したバンドとPCRで増幅したバンドのサイズを電気泳動で比較してみようと思います。ご意見ありがとうございます。 APさん アドバイスありがとうございます。試してみます。

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