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(無題) 削除/引用 No.4283-25 - 2015/07/30 (木) 00:32:14 - TK-1 LBに20mM Mg2+でやって10^8くらいは取れています。

(無題) 削除/引用 No.4283-24 - 2015/07/29 (水) 20:28:11 - AP Inoueの原報では「LB, SOB, SOCを試した結果、われわれの方法ではSOB, SOCが最も適していることがわかった」という記述のみで、データや、何を見てどのように評価したかの説明は一切なし。でもLBだったら全然ダメだったということはないはず。私もLBでやったことはある。 Inoue法はちゃんとやれば10^9 cfu/ug plasmidを越えるっていうんでしょ。ちょっとしくじって2,3ケタ落ちたとしても、ライブラリーでも作るんならともかく、単一の断片をクローニング（サブクローニングやリクローニング）くらいなら十分ですよ。 その点から、LBで培養して効率が落ちたとしても、液体窒素で保存するより一桁コンピーテンシーが下がるというけれど-80度で保存したとしても、実用上問題ないです。別トピで、液体窒素中に培養細胞のストックとコンピが同居しているんですけど、、という話題がありましたが、そもそもコンピを液体窒素で保存することが必要なほど難しい実験をしているのだろうか、と疑問に思いました。 達成できる性能と、コストや利便性を勘案した上でどうするかを決めたらいいんだと思います。ちゃんと考えて、わかった上でなら、少々常道を踏み外してもいい。でも、なんも考えずにアッケラカーンと逸脱したことをやるのはイケナイ。

(無題) 削除/引用 No.4283-23 - 2015/07/29 (水) 19:05:49 - bb 経験上ですが、LBで増やした大腸菌で作製したコンピテントセルを用いて、PCR産物のクローニング、制限酵素処理とライゲーションによるベクター作製（平滑末端含む）、組換えタンパク質の発現、と一通りの実験を行ってきましたが、全く問題はありませんでした。当たりのクローンを一つでも取れればいいような実験であれば、SOBである必要性はないように感じます。 思うに、最近はligaseの性能も改善されていることもあり、コンピテンシーが多少低くてもクローニングの効率がよくなっているのかもしれません。 ただし、私が使用したコンピテントセルは18度で培養したものです。 室温で培養したものでは、さらにコンピテンシーが低下することが考えられますので、可能であれば現状で18度で培養する方法を考えた方がよいでしょう。 また、コンピテントセルができているかを確認するのは、抗生物質を含まないプレートに播くのではなく、環状のプラスミドを用いてちゃんとコロニーが形成されるかを見ないと、どこが悪いのかわかりませんよ。もし、環状プラスミドでも全く菌が生えないのであれば、最初から作り直しですね。 プロトコールの見直しと、培養温度の改善が必要だと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.4283-22 - 2015/07/29 (水) 15:05:34 - con bb様, ポスドク様,　おお様、ご連絡ありがとうございます。 LBで増やした大腸菌の増えがものすごく悪いです。ですので、SOBでないと増やすのが難しいのかなーと考えていました。 やっとOD600の値が0.4を超えたところで、inoue bufferを用いて作成したところ、トランスフォーメーションをしても全く増えませんでした。薬剤が入っていないプレートにはもちろんびっちりと生えていました。正直何が原因なのかわかりませんが、培養時間が長すぎて、大方の大腸菌がその間に弱ってしまったり死んでしまったのではないかと考えています。 とりあえず、もう一度しっかりと確認してチャレンジしてみます。

(無題) 削除/引用 No.4283-21 - 2015/07/29 (水) 09:53:06 - おお まあ姿勢はともかくとして、LBで作ってしまったのならコンピテンシーを確認してどの程度の事ができそうか確認してみるといいと思いますよ。 LBでもいいという人の中にはconstructionじゃなくって、intactのプラスミドを考えている人もいるんじゃないかな。あとはルーチンに簡単なコンストラクトしかしないラボとか(ただあくまでもそう言う系より難しいことには使えない可能性を知ってないと足元すくわれます)。あと全体の流れの中で手抜きした方がいい事もありますからね。 最初はプロとコールに忠実にやってどんなものかつかんで欲しいですけど、特に経験を積んでいる最中の人は手抜きでどこまでできるか探索的なところはあっていいとも思います。 ttps://en.wikipedia.org/wiki/Super_Optimal_Broth SOB/SOCはtransformationにいいとされています。 Mgについては入れるといいということのようですが、どの様な作用か実証した人がいるんだろうか、、、コンピ作成用のbufferは二価の金属イオンなどがはいっていて、E. coliの表面につきやすくなっているのではないかという説明をきいたことがありますが、、、それも実証したものを見たことがありませんので、そう言われているようだとしかいえませんけど。 いま文献読めないですけど、 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283683802848

(無題) 削除/引用 No.4283-20 - 2015/07/29 (水) 09:21:28 - ポスドク こういうことはいうべきことではないかもしれませんが、LBかSOBかの違いにすら気づかず、実験を進めている感じ、またSOB作るの面倒だとかいう発言を聞くと、根本的な所に問題があるように感じます。。。 実験ってそんな甘くないですよ。 適当にやってると足元すくわれるぞ

(無題) 削除/引用 No.4283-19 - 2015/07/29 (水) 07:35:06 - bb コンピテンシーは下がるかもしれませんが、LBでも作れます

(無題) 削除/引用 No.4283-18 - 2015/07/28 (火) 18:38:27 - Con スレ主です。 私は井上法でDH5αのケミカルコンピの作成を試みました。 しかし、私はうっかりミスしていて、SOB培地ではなくLB培地を用いてコンピを作ろうとしていました。 培養時間も以上にかかりました。 やはりLB培地での作成は難しいのでしょうか？ SOBの中に入っているMgSO4が細胞に穴を開けplasmidを通しやすくするという解釈で正しいでしょうか？ SOBを作るのが面倒なので、SIGMAのHanahan’s Broth (SOB Medium) を購入して取り急ぎもう一度チャレンジしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4283-17 - 2015/07/23 (木) 00:45:10 - con 中年さん、たていすさん ご連絡ありがとうございます。 3種類作ったのでそのうちの一つがwoking hourにうまく行ってくれる事を願っています。 古典的？な方法で以前やりました。 そのときの保存液は塩化カルシウムとグリセロールだけという簡単な組成だったのがいけなかったのかもしれませんが、うまくいかずinoue method を試してみる事にしました。

(無題) 削除/引用 No.4283-16 - 2015/07/22 (水) 23:33:01 - 中年 No.4283-11にあるように３通りの希釈で培養しているなら、そのうちの一つは通常のworking hoursに落ち着くんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.4283-15 - 2015/07/22 (水) 22:07:44 - たていす >どうやら真夜中にコンピを作らなければならないのかもしれません。 そうなることを見越して、１２時間程度遅れて育つようなカルチャーをもうひとつ用意しておけばよいのです。 だけど、古典的な３７度の方法で十分じゃないのかな？？

(無題) 削除/引用 No.4283-13 - 2015/07/22 (水) 20:55:48 - Con APさん 原本のようなものをインターネットで見つけました。 それによるとDH5(DH5αではないですが・・・)で45〜50時間でOD600が0.4から0.8になるという記述がありました。 これが本当だとすると、どうやら真夜中にコンピを作らなければならないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4283-12 - 2015/07/22 (水) 15:32:18 - AP スターターカルチャーの菌濃度などによりますがO/N以上はかかるでしょう。 翌日からODモニターを始めて間に合うくらいです。 ちなみに、原法ではスターターカルチャーを使わず、シングルコロニー（あるいは数コロニーを集めて）からいきなり本培養を始めて、二終夜培養以上だったと記憶します。

18℃での培養について 削除/引用 No.4283-11 - 2015/07/22 (水) 11:49:26 - Con APさん、びぃりさん ご連絡ありがとうございます。 昨日、振盪培養器が開いていたのでなんとかそれで開始しました。 1コロニーを25mL中の培地で7時間37℃で培養後、うっすらと大腸菌が増えていたのが見えました。これを5mL,2mL,1mLを100mLの培地に移し18℃で振盪培養しました。 しかし、まったく増えていません。 増えるまでに時間が相当かかるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4283-10 - 2015/07/21 (火) 22:15:04 - ぴぃり 18℃, 200rpm, 2 O/Nで作ったコンピはかなりコンピテンシー良いですよ。 ラボによってつくり方がかなり違いますのでこの機会に色々調べてみてはと思います。 ネットで検索かけると結構出てくるかと思います

(無題) 削除/引用 No.4283-9 - 2015/07/21 (火) 15:43:50 - AP 私自身はスターラーで大腸菌を培養したことはありません（これまでレシプロ・ロータリーの振盪機がないラボにいたことはなかったので）。 このレポートでコントロール実験としてフラスコとスターラーの組合せでやっているみたいですが、1400 rpmでやっていますね。 まあ、器具や条件も違うでしょうから、実際やってみなければ正確なところはわかりませんね。 （ダイレクトでPFDダウンロード） ttp://www.vp-scientific.com/reference-pdf/Adaptive%20Laboratory%20Evolution%20with%20Tumble%20Stirring%20-%20UCSD.pdf

ごへんじありがとうございます 削除/引用 No.4283-8 - 2015/07/21 (火) 12:35:48 - con おおさん、APさんご返事ありがとうございます。 おおさん 氷上で冷やしながらvectorを細胞に導入し、また、42℃でheat shockする一般的なやり方に用いるコンピを作成したいと思っています。 APさん Inoue法がなぜ室温でincubateするのかわかりました。ありがとうございます。残念ながら振盪機自体がありません。ですので、スターラーを用いる方法を試してみたいと思っています。 ちなみに、もし、スターラーを用いて大腸菌培養の経験がございましたらどれくらいのスピードで回していたかなど教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4283-7 - 2015/07/20 (月) 21:43:26 - AP 培養用の振盪機でなくても、利用できる一般用の振盪機はないんですか。 スターラーでもいいかも知んない。

(無題) 削除/引用 No.4283-6 - 2015/07/20 (月) 21:37:44 - AP 室温で培養するのは高コンピーテンシーを達成するInoueの方法ですね(原法は18℃)。近頃は主流になってきてますね。 この方法が世に出る前は37℃で培養するのが普通でしたが、井上法が支持されているのからも明らかなように、高コンピーテンシーがコンスタントに得られない危険性は覚悟してください。 37℃で本培養すると、2~3時間以下でOD600=0.5に達すると思います。 培養を始めてから30分ごとに濁度をモニタするといいでしょう。二点以上の測定値を片対数グラフにプロットすれば、目的の濁度に達する時間をかなり正確に予測することもできます。

(無題) 削除/引用 No.4283-5 - 2015/07/20 (月) 21:24:47 - おお ケミカルコンピでしょうか?室温で増やすのはベストの菌の密度の幅が狭いためです(作り方にもよるかもしれません)。37℃で25mLでONのあと、OD 0.1ぐらいにあわせて37度だったら一時間前後じゃないかな。O/Nでやると大腸菌の増殖がすでにlog phaseを超えているからちょっと影響が出るかもしれない。もしそうなら、O/N culture からOD 0.1ぐらいにあわせて37度で前培養してさらにそれを1/4にしてまた1時間後とか。

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