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(無題) 削除/引用 No.4280-10 - 2015/07/24 (金) 18:44:35 - ルック fireさん 剥がれ具合がウェル間で異なるとばらつきにつながるためダメだと思います。 おおさん こんなのあったんですね。 もう少しシェーカーの速度が速いものを使用してみます。 それでダメなら使用を検討します。

(無題) 削除/引用 No.4280-9 - 2015/07/23 (木) 03:29:36 - おお >ただ24well plateくらいの大きさになってくるとスクレイパーは厳しそうですね。 The J-Hook version is curved on one end, to vertically lift cells from 6, 12, 24 and 48 Well Plates https://www.celltreat.com/accessories/cell-scrapers-cell-lifters http://www.usascientific.com/cell-scrapers-and-lifters.aspx まあさがせばありますよ。

(無題) 削除/引用 No.4280-8 - 2015/07/22 (水) 18:32:57 - fire > firefly, renillaの基質を溶かしたバッファーは余ったものを凍結し、 1週間くらいだと同じくらいの値が得られました。それ以上は試したこと無いので分かりません。 完全に剥がれなくても十分な発光値が得られるのならば、同じプレート上のものについては同じ操作をしたとして、比較してもいい？ダメ？ 溶解した後に一部をウェルサイズの小さな（高密度ウェル）プレートに移せば、発光試薬は節約できると思います。

(無題) 削除/引用 No.4280-7 - 2015/07/21 (火) 22:37:16 - ルック スクレイパーを使用されているということはやはり中々剥がれにくいのですね。 おおさんの方法で一度やってみます。 ただ24well plateくらいの大きさになってくるとスクレイパーは厳しそうですね。 293やC2C12などでは完全に剥がれたのでこのようなことは考える必要がなかったのですが。 申し訳ありませんがもう一点よろしいでしょうか？ firefly, renillaの基質を溶かしたバッファーは余ったものを凍結し、次回の実験に使用しても問題なく使用できるのでしょうか？皆さんはどう管理されていますか？

(無題) 削除/引用 No.4280-6 - 2015/07/21 (火) 12:16:10 - おお わたしはスクレーパーをつかって1Lぐらいのビーカーに1Lぐらいの水(実験で使えるグレードの水、イオン交換水とかRO水とかMilliQとか)をいれておいて、タオルペーパーを用意して、 ようはまずすべてのwellにlysis bufferをいれてから、スクレーパーではがして、そのスクレーパーは十分の水ですすいで(ビーカーに突っ込んでまわすだけ)、最後にタオルペーパーの乾いたところで水分を落として(形状にもよるけど二、三回たたくようにしてきる)、次のwellにというかんじでやってます。それでも気になるならビーカーを2つよういして、一つであらって次のビーカーでもう一度洗うといいかもしれません。活性がどうしてもきになるなら最初をアルコール2つめを水でもいいでしょう。流れ作業的に細胞をはがすことができますので、ピペッティングをいちいちやっているよりはいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4280-5 - 2015/07/21 (火) 03:09:12 - ルック >おおさん お返事いただきありがとうございます。遅くなりすみません。 あともう一点聞きたいことがあるのですが、細胞をライシスする際、キットに添付のlysis bufferを通常使うと思いますが、シェイカーを使用しても細胞が剥がれない場合みなさんどうしていますか？ pipetteのチップでグリグリやるのもいいのですが、数が24,48と多くなると正直やってられないので良い方法をご存知の方教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4280-4 - 2015/07/18 (土) 08:38:57 - おお >[Re:2] ルックさんは書きました : > あと、同一プレートで実験しないのであればrenillaを使うメリットは何なのでしょうか？ 検出感度とかじゃないでしょうか。transfectionの効率がいいなら反応溶液をケチることもできるかもしれないね。

(無題) 削除/引用 No.4280-3 - 2015/07/18 (土) 08:37:04 - おお >[Re:1] ルックさんは書きました : > 元々同じライセートを使用すれば別に同一プレートでなくても問題ないのでしょうか？ もんだいないよ

(無題) 削除/引用 No.4280-2 - 2015/07/18 (土) 04:14:27 - ルック あと、同一プレートで実験しないのであればrenillaを使うメリットは何なのでしょうか？

dual luciferase assayについて 削除/引用 No.4280-1 - 2015/07/18 (土) 04:06:58 - ルック dual luciferase assayについてご意見をいただきたく思いトピックを立てさせていただきました。 lusiferase assayでは主に目的のプロモーター活性をfirefly luciferaseで、内部標準としてrenilla luciferaseもしくはβ-galを使用するかと思います。 promega製品（他社製では同一プレートで測定できないものもあるかと思います）はfireflyを測定した後、そのウェルにrenillaの基質を入れることで同じサンプル内で２つの活性を測定しますが、β-galを内部標準とするときfireflyとβ-galは別々のプレートでの実験になります。 元々同じライセートを使用すれば別に同一プレートでなくても問題ないのでしょうか？ 同一プレートで全て見る方がより良いとは思いますが、promegaの試薬は非常に高いため他社製品をこのまま使い続けるべきか悩んでおります。 皆様のご意見をお聞かせください。

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