この度はお世話になります。標題の件に関して、皆様のお知恵を拝借したくトピックを作成いたしました。初歩的な事で大変恐縮ですが、よろしくお願い致します。
現在、ある遺伝子のノックアウト細胞をCRISPR/Cas9システムにより作製中です。
この遺伝子はユビキタスな組織分布を示し、様々な細胞の代謝サイクルに必要な遺伝子で、遺伝子欠損マウスは産まれて来ることが出来ません。
現在、END3血管内皮細胞にゲノム編集用プラスミドをトランスフェクションし、その３日後にOFP陽性細胞を96ウェルプレートに1個ずつ分取しました。２週間後、シングルコロニー１６個を４８ウェルプレートに移植しましたが、どのコロニーも全く増殖せず、丸くなったまま数日間プレート上に付いたままでいます。おそらくこれ以上増殖せず、死んでしまったのだと思います。
ただ16のシングルコロニーが全てがノックアウトではないはずなので、ゲノム編集効果とは無関係なことのように思います。空pEGFP-N1ベクターをトランスフェクトした6クローンでは48ウェル内で順調に増えています。gRNAをクローニングする前のCRISPRプラスミドのトランスフェクションは行いませんでした。
そこで質問なのですが、このようなことはCRISPR/Cas9によるゲノム編集の際によく見られることなのでしょうか？コロニーの大きさはウェルを１／８ほどを占めるほどの大きさで、それほどオーバーグロースにはなっていないと思います。96ウェル内に出来たコロニーをトリプシン処理して、再度同じ96ウェルに全て撒くと全てではないですが、いくつか足をいっぱい伸ばして接着しているものが見られます。
何かチップス等ありましたらご教示頂けないでしょうか？
大変稚拙な内容で恐縮しておりますが、どうぞよろしくお願い致します。 |
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