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(無題) 削除/引用 No.4264-9 - 2015/07/14 (火) 11:52:19 - おお 論文かそのリファレンスにかかれているから、シグマにその配列で依頼できたということですよね。。。配列がわからないけど合成してとはシグマにはいえませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.4264-8 - 2015/07/14 (火) 11:30:52 - AP >論文を参考して、 そのプライマーが種をどのようにして見分けているのかは、記述があるか、自分で調べてみればわかるわけですね。

(無題) 削除/引用 No.4264-7 - 2015/07/14 (火) 10:24:02 - azuma ＞AP様 ご助言ありがとうございました。とても勉強になりました。 手元にあるプライマーは情報が詳しくありません。当方の自身で設計したものではなく、論文を参考して、シグマに合成を依頼したものです。 理想的に自分で設計したいですが、その当たりの知識がなく、論文に参考することしかできませんね（笑）。プライマーの設計は難しいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4264-6 - 2015/07/13 (月) 12:31:23 - AP >特定の動物のspecies specific primerを採用したものです。 どういうふうに配列に特異性が与えられているのでしょうか。 全長にわたり、その生物種にしか存在しないユニークな配列なんですか？ そうではなくて、多くの場合、種間に保存されているカウンターパートの配列で、塩基置換のある部分からプライマーを選ぶんじゃないですか。そのとき、置換のある塩基が3'末端にくるようにデザインすると、プライマー3'末端にミスマッチがあるとDNA伸長が起こりません。これによって、目的種だけで増幅が起こり、異種では増幅が起こらないというのが原理です。 しかし、proof reading活性があるとプライマーの3'ミスマッチは削った上、伸長を再開するので、種特異性がなくなります。 もし、3'ミスマッチを利用したタイピングをしているのなら、proof-reading活性のない酵素を選ぶのは自明です。

(無題) 削除/引用 No.4264-5 - 2015/07/13 (月) 11:40:46 - azuma ＞おお　様 ご回答ありがとうございました。プライマーについてはいろんな論文から参考し、特定の動物のspecies specific primerを採用したものです。特異バンドがあるかどうかの判定です。 ＞mon　様 重要なヒントを提供していただいて、ありがとうございました。今後、反応組成について、検討したいと思っています。また、特異性を重視する場合、Proofreading機能を持ったない反応キット（酵素）を選んだほうがよろしいでしょうか？ 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4264-4 - 2015/07/13 (月) 06:30:21 - mon おおさんのご指摘のようにproofreadingによって、primerの3'が削れてアニールしているかも。

(無題) 削除/引用 No.4264-3 - 2015/07/13 (月) 06:27:05 - mon 同じPCR酵素反応液でも、Mg濃度、Betaine添加、DMSO添加によって「特異性」というかprimerのアニールし易さ・増幅性が変わります。

(無題) 削除/引用 No.4264-2 - 2015/07/13 (月) 02:58:26 - おお 酵素によってかかったり、かからなかったりということはありますのでそう言うことはあるかもしれません。 プライまーをどの様に設定して、どのような違いを見ようとしているのかよくわかりませんので何ともいえないですけど、proofreadingによって期待してないものも増えている可能性はないでしょうかねぇ。

PCR 酵素種類によってプライマーの得意性がなくなる。 削除/引用 No.4264-1 - 2015/07/12 (日) 23:47:43 - azuma 皆さんの助言からいろいろ参考してきました。感謝しています。 今回の疑問は、酵素種類（PCR反応キット）によって得意性のあるプライマーは得意性でなくなった質問です。PCR反応に詳しい方に伺います。 ある種の動物を特定しようと試み、種の得意性のあるプライマーを使って、ジェノタイピングしていますが、よく得意性を示すPCR反応キットですと、増幅が悪いですが、よく増幅できるKOD FX Neoを使うと今度は得意性がなくなった場合があり、動物の種類の鑑別は安定しませんでした。そのようなことが起こり得るでしょうか？あるいは、PCR反応用のDNAサンプルが問題、または技術的な問題なのでしょうか？ 皆さんのご回答・ご助言をお待ちしております。よろしくお願いいたします。

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