いつも勉強させていただいております。
mouse 胎生期18.5日目の骨組織（頭蓋骨calvariaおよび肋rib）に注目しています。
胎児からsoft tissuesを除き、残ったcalvariaおよびribよりタンパク質抽出を行い大のですが、大きく分けてプロトコールが二種類あるようです。
SDS-PAGEにて見たいものは、コラーゲンtype1, type2や細胞内タンパク質です。
どちらの方法が良いのか、経験をお持ちの方がいらっしゃいましたらご教示いただければ幸いです。
まず一つ目のプロトコルは、
1. soft tissuesを除いた骨組織の入ったチューブを液体窒素に浸ける
2. 乳鉢と乳棒を用いて粉末にする
3. RIPA bufferを加える
4. 13,000xg, 15 min遠心して、上清を回収
5. 必要ならここからTCA/acetone沈殿またはタンパク質濃度測定
二つ目のプロトコルは、
1. soft tissuesを除いた骨組織の入ったチューブを液体窒素に浸ける
2. 乳鉢と乳棒を用いて粉末にする
3. 4Mグアニジン塩酸(pH7.4)を加え、一晩ローテーションさせる
4. 遠心により生じたペレットを4Mグアニジン塩酸(pH7.4)でリンス、再び遠心（上清は捨てる）
5. ペレットを透析膜に入れ、水に対して透析を行う
6. 凍結乾燥
です。
まずE18.5のマウス組織からですので、乳鉢乳棒を使わず、できるだけロスの無い方法で抽出ができればと思っています。昔drosopholaを扱っていた時にはエッペンドルフチューブでマッシュできる棒のようなものでdrophilaからlysateを調製していましたが、今のラボにはそれがありません。
また、二つ目の方法ではどちらかというと細胞外マトリックス（コラーゲンやグリコサミノグリカン）の抽出に使っているようでしたが、ステップがかなり多く、ロスも多くあるのではとの懸念があります。
1の方法でも十分にタンパク質（コラーゲンも興味対象です）が溶出できるのであれば、それでできればと思っています。または以外の方法をとられている方がいらっしゃいましたらご教示いただけないでしょうか？
硬組織からタンパク質抽出を行った経験がおありの方がいらっしゃいましたら、情報を共有させていただけますと幸甚です。
どうぞ宜しくお願い致します。
|
|
このスレッドをはてなブックマークに追加