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(無題) 削除/引用 No.4258-9 - 2015/07/17 (金) 09:21:37 - KM 返信が遅れてしまい申し訳ございません。 ＞弘法様 そのような影響はすでに報告されていたのですね。 論文まで引用して下さりありがとうございます。 ＞yeast様 アドバイスあがとうございます。 確かに、フレームシフトの場合でも機能喪失は出来ますね。 ＞おお様 何度もご意見ありがとうございます。 polyAサイト付加方法についてももう少し調べてみようと思います。 みなさま沢山のアドバイス本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4258-8 - 2015/07/13 (月) 14:54:20 - おお とにかくpolyAサイトがあれば、そこから下流に転写が進むでしょうけど、polyAサイトで切れてpolyAを付加してくれるので、LYS1の発現に大きな影響を与えなくなるだろうということです。だからpolyAサイト以降のことは考えなくていいんじゃないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.4258-7 - 2015/07/13 (月) 13:08:11 - yeast 全置換しなくて、ORF5'側に挿入変異で機能欠損させればよいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4258-6 - 2015/07/13 (月) 12:50:38 - 弘法 もちろん、問題にしている遺伝子のノックアウトにより隣の遺伝子の発現が影響を受けること（Neighboring-gene effect）は十分にあり得ます。遺伝子破壊ライブラリーは単にORF全長に相当する領域をマーカーに置き換えているだけなので、Neighboring-gene effectについては考慮されていません、というか、ありとあらゆる生育条件で全てのNeighboring-geneの発現を野生株と比較することなど、原理的に不可能です（ありとあらゆる生育条件なるものを定義しようがないので）。Neighboring-gene effectとその考察については既に論文もあります。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22306811/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22453910/

(無題) 削除/引用 No.4258-5 - 2015/07/13 (月) 11:01:16 - KM ご返信有難うございます。 >原核生物にはterminator (転写終結配列)があるけれど、真核生物にはないというのが一般論ですが、酵母にはそれに相当するものがあるようですね。 私自身転写終結に関して勉強不足でして、あまり理解できていませんでした。 >ポリA付加シグナル自体は転写終結因子ではありません。転写がもっと下流にリードスルーして行ったあとで、aataaaが認識されてプロセッシングを受けるわけで。 ご説明有り難うございます。色々と調べてみたのですが、終止コドンから大体何bpぐらいまで見ておけば安心、ということもよくわかっていないようですね。(ヒトβグロビン遺伝子の場合、ポリアデニル化部位の1.7 kbp下流まで転写が及んでいると書いていました。) ということは、LYS1の転写終結部位(今まで誤ってターミネータと書いていました)が、MGA2の配列に重なっているということは十分ありえる、ということになりますね。 そうすると、世に出ている遺伝子破壊ライブラリーはこのようなことまで考慮したりしてるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4258-4 - 2015/07/13 (月) 10:24:47 - AP 扱っている生物種が異なる人たｃｈのあいだで話がかみ合っていないようなので、僭越ながら、 原核生物にはterminator (転写終結配列)があるけれど、真核生物にはないというのが一般論ですが、酵母にはそれに相当するものがあるようですね。ポリA付加シグナル自体は転写終結因子ではありません。転写がもっと下流にリードスルーして行ったあとで、aataaaが認識されてプロセッシングを受けるわけで。

(無題) 削除/引用 No.4258-3 - 2015/07/13 (月) 09:59:51 - KM 早速のご返信有難うございます。 ＞ゲノムの配列から予測は難しいんでしょうか?あるいはご自身でどこでtranscriptionが終わるか決めればどうでしょうか。 これはLYS1のことについてでしょうか？ 配列など(ポリアデニル化シグナルAATAAや、それに続くGTに富む配列)を確認しましたが、見つけることが出来ませんでした。 ＞それかつぶしたときにpolyA site(ターミネーターですか)が入るように仕組むか。 確かにそういう方法もありそうですね。しかし、polyA siteをつけるだけで転写が即終了する、というわけでもなさそうですね・・・

(無題) 削除/引用 No.4258-2 - 2015/07/11 (土) 11:15:25 - おお データーベースではCDSいがいはnot completedとかになっていて全長mRNAの配列がないですね。 酵母ではターミネーターっていうんですかね。まあいずれにしろpolyA siteだと思いますが、ないとさらにtranscriptionが先に進むような気がしますが、どこまで続けられるのかよくわからないですね。。。中途半端にとまってしまったのはpolyAはつかないでしょうし安定性がないと思います。 ゲノムの配列から予測は難しいんでしょうか?あるいはご自身でどこでtranscriptionが終わるか決めればどうでしょうか。よくわからない状態でやって、後でMGA2つぶしたからなのか、LYS1の発現が低下したからなのかよくわからないとなると、何をやってきたのか、、、てな事になるとどうかなぁと思うので。 それかつぶしたときにpolyA site(ターミネーターですか)が入るように仕組むか。

遺伝子破壊の際のターミネーターの影響 削除/引用 No.4258-1 - 2015/07/10 (金) 17:07:29 - KM 初めて利用させていただきます。 ただいま、酵母(S.cerevisiae)の遺伝子破壊を行っており、MGA2をYAP1のマーカーで置き換える予定です。 通常ですとMGA2の開始コドンと終止コドンの上流と下流にプライマーを設計してプラスミド上のYAP1をPCRで増幅させ、形質転換をすると思うのですが、このMGA2という遺伝子はワトソン鎖にあり、終止コドンの150bp下流にクリック鎖にあるLYS1という遺伝子の終止コドンがあります。 そこでふと思ったのですが、MGA2配列の一部にLYS1のターミネーターが含まれていれば、このようにしてMGA2が破壊された株にはLYS1のターミネーターが含まれず、上手く転写〜翻訳されないかもしれないという可能性はあるのでしょうか。 そのような場合には、プライマーをMGA2の終止コドンからいくらか上流(300bpぐらい？)にプライマーを設計しなければならないのでしょうか。 それとも、ある遺伝子上に他の遺伝子のプロモーターやターミネータが存在することは通常ないのでしょうか。 理解し難い部分があれば申し訳ございません。 ぜひとも、ご回答をよろしくお願いいたします。

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