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(無題) 削除/引用 No.4257-7 - 2015/07/10 (金) 14:00:18 - AP heteroduplexを含むプラスミドがheteroduplexを維持したまま複製されることはないですよ。大腸菌の中に入れば、直ちにミスマッチ修復されるか、最初の複製の時にそれぞれの鎖を鋳型にしたhomoduplexになるか（そしてpropagateしていくうちにどちらか一方のプラスミドだけを含むクローンとなる）でしょう。

(無題) 削除/引用 No.4257-6 - 2015/07/10 (金) 13:10:59 - おお >[Re:5] PCRの齟齬さんは書きました : > AP様、早速のコメントをいただきありがとうございます。 > > TAクローニングして、colony PCRで陽性のものを20個sequencingしましたが、 > うち、1個のクローンがWTと50塩基の欠失型の両ピークが出ました。当初は２つの大腸菌コロニーがコンタミしたかと思いましたが、ご指摘いただいたheteroduplexの可能性がありますね。 いや、ないですよ。大腸菌のコロニーからインサートがヘテロの状態のプラスミドがとれるわけはないでしょう。 両者が混在したゲノムから増幅するからそう言うことがおこる可能性があると指摘しているだけです。

(無題) 削除/引用 No.4257-5 - 2015/07/10 (金) 11:42:31 - PCRの齟齬 AP様、早速のコメントをいただきありがとうございます。 なるほど、一本鎖を認識するヌクレアーゼというものがあるんですね。 知りませんでした。私も最初、mis-match特異的なヌクレアーゼで処理をしてみようかと考えていました。 やはりheteroduplexの可能性がありますね。 サイクル数は38サイクルで、多い方です。 TK-1様、コメントいただきありがとうございます。 >TA-cloningした欠失アリルのクローンからPCRしたら短くなるんですかね。 これは確認していません。 ただ、欠失アリルのTA cloneからEcoR1で切り出されるbandは予想分子量通り、200塩基程度でした。 TAクローニングして、colony PCRで陽性のものを20個sequencingしましたが、 うち、1個のクローンがWTと50塩基の欠失型の両ピークが出ました。当初は２つの大腸菌コロニーがコンタミしたかと思いましたが、ご指摘いただいたheteroduplexの可能性がありますね。 ただ1/20なんですよね・・heteroduplexのTA vectorへのligation効率に影響を与えている可能性も否定できませんが。 >ヘテロの株をつくったところで、この次に何かできればいいですがね。 ホモで欠失させると細胞が死んでしまうようなんです。そこで半分だけ減らした効果を見ようとしています。

(無題) 削除/引用 No.4257-4 - 2015/07/10 (金) 11:18:49 - TK-1 TA-cloningした欠失アリルのクローンからPCRしたら短くなるんですかね。まあ、そんなことより、ヘテロの株をつくったところで、この次に何かできればいいですがね。

(無題) 削除/引用 No.4257-3 - 2015/07/10 (金) 10:26:20 - AP それを確認したところで、実験上のメリットはないでしょうが、もしやるなら、 S1 nucleaseやMung been nucleaseで処理して電気泳動して欠失型サイズになるかどうか、ですね。

(無題) 削除/引用 No.4257-2 - 2015/07/10 (金) 10:11:06 - AP それで説明がつくかどうかわかりませんが、 野生型鎖と欠失鎖でheteroduplexが出来ているため、高次構造により移動度が低くなったものがあるんじゃないでしょうか。 PCRサイクルが過剰ではありませんか。

DNA sequenceデータとPCR bandの齟齬について 削除/引用 No.4257-1 - 2015/07/10 (金) 09:50:14 - PCRの齟齬 お世話になります。 一点解釈に困っているデータがあります。コメントいただけますと幸いに存じます。 ある細胞（仮にAとさせてください）と、その亜株（仮にBとします。）のDNA配列解析をしています。 Aに関して、興味ある遺伝子Xは両alleleともに野生型です。 一方Bに関しては、遺伝子Xの片側のalleleに50塩基の欠失（エクソン5番の内部です。）があることがわかっています。（DNAシークエンサーの結果） このことは、以下の方法により確認したものです。 まずエクソン4およびエクソン6に相補的なPCRを設計し、genomic PCRを行いました。 ------> エクソン4 - イントロン - エクソン5 - イントロン - エクソン6 <----- 野生型の予想されるPCRのbandの分子量は250 ntです。 一方、欠失型では200 ntがでると予想していました。 実際、細胞A, Bそれぞれからgenomeを取り出し、上記のPCRを行うと、Aでは一本のみbandが、Bでは二本のbandが確認され、その二本のbandの分子量差は約50塩基ほどで予想された通りです。 ところが、おかしなことに、Bで出る欠失型と思われるbandは、野生型よりも重い分子量側に出てきます。二度行いましたが結果は同じでした。 BからのPCR産物をTA cloningして、sequenceすると、予想通りの野生型と50塩基欠失したクローンが50:50の確率で読まれました。 ただ、なぜ50塩基欠失しているはずのalleleのbandの移動度が、野生型よりも遅くなる理由がわかりません。PCRはうまくいっており、AでPCRを行うと一本のbandしか出ません。 変異型のPCR産物の３次構造？など分子量以外の要因がアガロースゲル電気泳動の移動度に影響を与えるなどということはあり得るのでしょうか？ 大変稚拙な質問で恐縮ですが、どうか宜しくお願い致します。

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