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(無題) 削除/引用 No.4254-5 - 2015/07/09 (木) 17:48:26 - Az 皆様、ご多忙の中、貴重なアドバイスを頂きありがとうございます。 toyo様、おお様、中年様のご意見を参考にして改善点を踏まえて再チャレンジしてみます。 これまではメンブレンをポリ袋に入れてシールして、ゲル板で挟んで振盪していました。少し改善させて溶液の動きが生じる程度になりましたし、１次抗体を４℃でONにする際の重石を偏らないように注意しました。 ストリッピングについては、市販のものを使用していますが、３７℃で１時間インキュベートしていたので、条件を再検討してみます。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4254-4 - 2015/07/08 (水) 22:50:00 - 中年 おおさんの仰るように、ECLで生じるラジカルが抗原を損なうのだと思います。私の経験からも、発光が激しい時にストリップ後のシグナルが落ちる気がします。

(無題) 削除/引用 No.4254-3 - 2015/07/08 (水) 22:28:51 - おお わたしのもあまりstripping後はいい印象がないですが、、、かといってこうすれば定量ができるという実験evidenceをもっていえる方法もないです。なので皆さんどうされているのかと私もおもうわけです。 わたしがよくとっている方法のひとつはstrippingしない。比較的シグナルが弱く出るサンプルからはじめる。また種の違う抗体をできるだけ使う。見ているサイズが違えば、最初にでたバンドが次の検出で見えても邪魔しないのでそれでもOKとしてます(本当に強いシグナルが出て、抗体がいい抗体ならstrippingしてもシグナルが出てしまうことがあるので、) もう一つ気になるのはECLの反応が強いとき、2回目に同じ場所のECLの反応が弱くなったり、なくなったりすることがあります。なにか酸化反応とかで抗原せいがおちているのか、最終プロダクトが膜に吸着していて反応速度が落ちているのか、、、よくわからないのですけど。またこれはECLのキット二よっても若干特性が違うように思います。GEがECL plusを出すより前の初期型ECLはそう言う傾向が少ない用に思いますがCCDカメラではちょっと感度が追いつかないことも多いかと。 あとは酸性に振ったすトリッピングはとくにいい印象がありません。SDSを0.1%ぐらいにしてなるべく熱をかけないで洗うか、0.1M NaOHで洗うかぐらいにしています。

(無題) 削除/引用 No.4254-2 - 2015/07/08 (水) 20:15:54 - toyo ・ローディングコントロールはとれていますか? 個人的な感想ですが、ストリッピングはあまり定量に向かないように思います。 泳動マーカーを参考に、PVDF membraneの調べたいバンドのある高さを切り分ければ、ストリッピングをしなくても同じmembraneから複数のバンドが定量できます。 あるいは、transfer直後にmembraneをponceau Sで染めてもある程度参考になるかと思います。 ・抗体処理などの際に振盪していますか? 抗体処理などの際に振盪しないと、抗体の吸着が不均一になり、ムラの原因になります。 シールした袋を傾けたり、一部に重石を置くなどして、抗体溶液の分布が偏った状態で実験すると分かるかと思います。 シーソー型振盪機などで溶液の動きが生じる程度に、袋に入れる液量を多めにしてみてはいかがでしょうか。 使用する抗体量が同じでも、希釈率を変えれば液量を増やせます。 検出系によってはS/N比が低下し得ると思いますが、定量性との兼ね合いでバランスを取ってください。

ストリッピング後のウエスタンのバンド強度が違う 削除/引用 No.4254-1 - 2015/07/08 (水) 17:36:40 - Ａｚ いつも勉強させて頂いています。 今回、初めて質問させて頂くのですが、 ウエスタンブロットのバンド検出の結果が安定せずに迷走しています。 是非、皆様のお力をお借りして、解決できれば幸いです。 4月から新しいラボに移動して、マウス骨格筋サンプルを用いてウエスタンをしているのですが、バンド検出でバンド強度にムラが生じます。 また、ストリッピングした後に同様のプロトコルで同じ抗体を使ってみると 同じサンプル（同じレーン）のバンド強度が弱い（または強い）ことがあります。 以下、転写からのプロトコルです。 1, Bio-radのtransfer blotで転写（PDVFメンブレンを使用） 2, milliQで軽く洗浄 3, ブロッキング（2% BSA in PBS）1hr r.t. 4, 洗浄（0.05% Tweenを含むPBS, 以下PBST）計30分 5, 1次抗体（1:250 希釈 by 2% BSA in PBS） O.N. 4℃ (*1次抗体はものによって250〜1000倍希釈しています） 6, 洗浄（0.05% Tweenを含むPBS, 以下PBST）計30分 7, 2次抗体（1:10000 希釈 by 2% BSA in PBS）1hr r.t. 8, 洗浄（0.05% Tweenを含むPBS, 以下PBST）計30分 9, Bio-rad ECL substrate 1 min 10, Bio-rad ChemiDox XRS+で検出 尚、ブロッキング、1次抗体、2次抗体は市販のチャック付ポリ袋を切って、シーラーでシールしています。液量は約1ｍｌです。 気泡が入らないようにしたり、メンブレンが乾かないようにと、基本的なところはできていると思うのですが、同じサンプルを異なるレーンに流してもバンドは検出できるのですが、同じバンド強度ではなく片方が薄かったりムラがあったりします。 転写前と後のゲルをＣＢＢで染色して比較しましたが、転写はうまくいっているようです。 先輩方、是非アドバイスを頂けましたら幸いです。

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