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クロマチン免疫沈降後の評価の具体的な方法について トピック削除
No.4253-TOPIC - 2015/07/08 (水) 16:14:26 - チップ初心者です
クロマチン免疫沈降初心者です。

現在、ある転写因子が、特定遺伝子プロモーター領域に結合しているかどうかについて調べています。また、CSTのChIPassay kit （9003）を用いております。

あまりにも基本的すぎる質問で、自分なりに教科書やネットでの情報を検索してみたのですが、やはりトピックのタイトルの事が分からず、皆様のお力を貸して頂ければ幸いです。

クロマチンで免疫沈降した後得られたDNAを、通常はPCRやリアルタイムPCRで評価すると思われますが、その場合、templateの量や濃度はどのようにすれば良いのですか？

（１）結合しているか否かだけを評価するのであれば、Inputと、normal IgGで免疫沈降したサンプルと、特異的抗体で免疫沈降したサンプルを、それぞれ同量ずつ用いてPCRをかけるのでしょうか？それとも濃度を揃えるのでしょうか？（これまでにやった場合は、核酸の濃度を測定するとinputが多く、normal IgGで免疫沈降したサンプルの濃度が低かったのですが・・・）

（２）リアルタイムPCRで評価する場合は、inputサンプルで希釈系列をつくって検量線を引き、特異抗体で免疫沈降したサンプルとnormal IgGで免疫沈降したサンプルを、その検量線上で比較するのではないかと推測しているのですが、その場合もtemplate の量を揃えて（濃度は揃えないで）、PCRにかけて良いのでしょうか？


不勉強に対するお叱りの言葉でも構いません。
お勧めの教科書やHP等ございましたら、ご紹介頂けると幸いです。
どうぞ宜しくお願い申し上げます。
　
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有り難うございました。 解決済み 削除/引用
No.4253-7 - 2015/07/14 (火) 16:41:11 - チップ初心者です
おお様、先日はお返事を下さり、有り難うございました。
その後試行錯誤し、よその講座の先輩に尋ねる機会などにも恵まれ、トピを立てた時よりも少しは、理解が進んだように思われます。

ChIP後に、リアルタイムPCRでのenrichmentの解析する場合の考え方として、参考になったサイト（ライフテクノロジーのサイトです）を下記に貼り付けておきます。

https://www.lifetechnologies.com/jp/en/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html

有り難うございました。

(無題) 削除/引用
No.4253-6 - 2015/07/09 (木) 09:46:29 - おお
>実験の設計が間違ってい
というのは同量のDNA量でPCRをかけるという方法論です。

おお様、有り難うございます。 削除/引用
No.4253-5 - 2015/07/09 (木) 08:50:10 - チップ初心者です
おお様、いつもご指導有り難うございます。
ご指摘の通り、理想通りであれば、normalIgGの濃度測定では限りなく0に近い値が出る筈なので、同体積で良いと考えておりました。
ただ、身近な方からのアドバイスで、（私の受け取り方がまずかったのかもしれないのですが）、「可能ならばDNA量は揃える」という内容のものがあり、少し混乱しておりました。

本日新たにサンプルができあがる予定ですので、まずはそれを同体積とって、PCRで評価してみます。

あとは、実験の設計（そもそもの仮説も）が間違っているかもというご指摘ですが、それも十分にあり得る話だと考えております。
何度か頑張ってやってみて、適宜見切りをつけます。

アドバイス、有り難うございました。

(無題) 削除/引用
No.4253-4 - 2015/07/08 (水) 23:50:12 - おお
あとネガこんでdnaが測れてテストのサンプルに合わせれるぐらいあるなら、もしかしたらip条件の改善の余地があるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4253-3 - 2015/07/08 (水) 21:55:05 - おお
Normal IgGでは理想的にはDNAがないという前提で考えると、DNA量を測ってそろえるのは無理がある方法ではないでしょうか?もし測れて、同量のDNAを使ったとしたならバックグランドのシグナルを強調しているだけじゃないでしょうか。理想的な状態ならDNAは0なのでどれだけ集めてもテストのサンプルと同量にはなりませんよね(実験の設計が間違っているっていうこと)。

IPしてあるかないかの評価だから、コントロールとテストでIP complexesを同様に処理して体積で同量とって評価すればいいのではいいと思いませんか?

クロマチン免疫沈降後の評価の具体的な方法について 削除/引用
No.4253-1 - 2015/07/08 (水) 16:14:26 - チップ初心者です
クロマチン免疫沈降初心者です。

現在、ある転写因子が、特定遺伝子プロモーター領域に結合しているかどうかについて調べています。また、CSTのChIPassay kit （9003）を用いております。

あまりにも基本的すぎる質問で、自分なりに教科書やネットでの情報を検索してみたのですが、やはりトピックのタイトルの事が分からず、皆様のお力を貸して頂ければ幸いです。

クロマチンで免疫沈降した後得られたDNAを、通常はPCRやリアルタイムPCRで評価すると思われますが、その場合、templateの量や濃度はどのようにすれば良いのですか？

（１）結合しているか否かだけを評価するのであれば、Inputと、normal IgGで免疫沈降したサンプルと、特異的抗体で免疫沈降したサンプルを、それぞれ同量ずつ用いてPCRをかけるのでしょうか？それとも濃度を揃えるのでしょうか？（これまでにやった場合は、核酸の濃度を測定するとinputが多く、normal IgGで免疫沈降したサンプルの濃度が低かったのですが・・・）

（２）リアルタイムPCRで評価する場合は、inputサンプルで希釈系列をつくって検量線を引き、特異抗体で免疫沈降したサンプルとnormal IgGで免疫沈降したサンプルを、その検量線上で比較するのではないかと推測しているのですが、その場合もtemplate の量を揃えて（濃度は揃えないで）、PCRにかけて良いのでしょうか？


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どうぞ宜しくお願い申し上げます。
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