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返信ありがとうございます 削除/引用 No.425-10 - 2012/04/26 (木) 19:08:27 - 内皮 ＞組織様 返信ありがとうございます。 先程肝臓をFITCダイレクトラベル抗CD31抗体で染色してみたのですが血管が染まらず、二次抗体のみの場合と同様にバックグラウンドのみでした。抗体の詳細を調べてみるとタイプがIgGでFACSでのみ結合の報告があると記載されていました。やはり組織様の述べられているように交差反応の可能性が高いと思われます。マウスの血清を購入してやってみようと思います。 バックグラウンドといってもこんなにも原因が別れるんですね…。本当に勉強になりました。これから免疫染色についてもっと勉強していきたいと思います。ご教示していただきありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.425-9 - 2012/04/26 (木) 14:16:55 - 組織 抗体なしの切片でバックグラウンド（自家蛍光）がなく、Fcレセプターの分布とも違うとすれば、内因性IgGと二次抗体の交差反応の可能性が高いでしょうね。 抗体なし：自家蛍光 二次抗体のみ：自家蛍光＋二次抗体由来の非特異反応（Fcレセプター，内因性IgGとの交差） normal IgG＋二次抗体：自家蛍光＋二次抗体由来の非特異反応＋抗体IgGの組織への非特異的吸着 上記のように、ひとえにネガコンといっても出てくるバックグラウンドの原因はそれぞれ違いますので、うまく使い分けることで問題の切り分けができると思います。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.425-8 - 2012/04/26 (木) 11:37:18 - 内皮 ＞組織様 返信ありがとうございます。 すみません、読み間違えていました。自家蛍光を見るということですね。一度だけですが抗体なしでやってみましたがCD31の緑の蛍光は見られませんでした。また、私もFcレセプターの可能性を思いつきましたので脾臓で一次抗体の代わりに抗CD16/32抗体を使用してブロッキングした後にFITCダイレクトラベルの抗CD31抗体を用いて染色してみたところドット状の蛍光は減少しましたが全体的にバックグラウンドが残ったままでした。(抗CD16/32抗体、抗CD31抗体ともにrat由来なので後者をダイレクトラベルのもので行いました)肝臓ではまだやっていないのでわかりませんが今日行う予定です。ただやはりダイレクトラベルを用いると二次抗体まで用いた場合と比較して全体的にやや蛍光強度が落ちている感じが否めませんでした。 マウスの血清で希釈することで交差反応は抑えられるんですね。マウス血清を購入してやってみます。色々と教えていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.425-7 - 2012/04/26 (木) 11:00:02 - 組織 二次抗体がwhole IgGであれば、Fc receptorと二次抗体の結合も考慮する必要がありますね。実際にどこまで問題になっているかは分かりませんが、ドット状に染まるというパターンが気になります（血管内皮の染まり方ではないと思います）。まあ造血器を染める場合は、吸収済みのフラグメント抗体を使う方が無難かもしれません。 内因性IgGの問題は、代替法として、二次抗体を10%程度の正常マウス血清で希釈することで、内因性マウスIgGと二次抗体の交差反応を抑えられます。お試しください。 >固定なしの方法はしたことがなかったのでやってみます 誤解されてるようなので、固定は必ずして下さい。 後固定にはそれほど効果がないかも、という意味です。 既固定凍結切片：凍結包埋前に組織を固定 未固定凍結（新鮮凍結）切片：凍結・薄切した後に固定

返信ありがとうございます 削除/引用 No.425-6 - 2012/04/25 (水) 20:42:04 - 内皮 ＞組織様 返信していただきありがとうございます。 固定なしの方法はしたことがなかったのでやってみます。後固定もなしでやったほうがいいのでしょうか。 二次抗体は調べてみたところbovine,goat,rabbit,rat,humanのIgGとhuman serumに対しては吸収処理をしているようです。ただ私が行っているのはマウスの組織ですのでmouse IgGとmouse serumに対して吸着処理を行っていないので交差反応が生じている可能性はあると思われます。抗体自体はF(ab)'2でなくwhole antibodyです。 脾臓の染色に関してですが抗CD31抗体を一次抗体に用いると脾臓内にいくつか卵状にバックグラウンドが極端に低い部分が現れ、ドット状にいくらか染まっている様子が観察できたのですがこれは血球細胞と考えていいのでしょうか。血管らしい管状の染まり方をしているわけではなく、さらに投与した蛍光リポソームと完全に一致しています。

(無題) 削除/引用 No.425-5 - 2012/04/25 (水) 17:33:56 - 組織 内因性IgGが二次抗体と反応しているかもしれませんね。 脾臓では赤脾髄にバックグラウンドが出ているように思えますので。 薄切した切片をPBSにつけてすぐに封入してみて下さい（二次抗体もなし）。 この切片で、二次抗体のみのネガコンでみられたバックグラウンドがなければ，内因性IgGの可能性が高いでしょう。 二次抗体は吸収処理済みのものを使われていますか？ また、二次抗体はF(ab')2フラグメントでしょうか？ ちなみに凍結切片の場合、抗原賦活は基本的に不要です。 あと、既固定凍結切片なら、後固定は省略できるかもしれません。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.425-4 - 2012/04/25 (水) 12:12:15 - 内皮 KT様、るん様、返信していただきありがとうございます。 再度肝臓の血管を染色してみたのですが、その際に二次抗体のみで染色してみたところ一次抗体ありの時と同程度の高いバックグラウンドが観察されました。バックグラウンドの原因は二次抗体と思われます。ただ、腫瘍や肺などではここまで高いバックグラウンドは出ませんでした（両者ともほぼバックグラウンドなし）。ちなみに二次抗体濃度は400分の1にしています。 ＞KT様 投与したリポソームと血管内皮の関係性をみるための染色を行っています。リポソームは肝臓と脾臓に蓄積しやすいので、どの程度残留しているかを観察するのは結構行われています。 前固定なしではやったことがないのでやってみようと思います。この場合は後固定は必須でしょうか。後固定をするとるん様が述べられているように賦活化をしないといけないでしょうか。 ＞るん様 肝臓においてバックグラウンドは高いですが血管は染まっていることはわかる程度には光っています。研究室ではOCT埋包凍結切片には抗原賦活化はしない方法が主流になっていますので今まではしていませんでした。腫瘍や肺などでは賦活化なしでもきれいに染まっています。 賦活化することでバックグラウンドが下がることはあるのでしょうか。もし賦活化する場合は0.1%proteinaseKで室温3分間処理でいいのでしょうか。賦活化の手順をやったことがなく研究室内にもした人はいませんでした。方法を調べてみたのですがいくつか方法がありどれがいいのかわからないのですが一般的なのはどういった操作が最適になるんでしょうか。聞いてばかりで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.425-3 - 2012/04/24 (火) 16:59:37 - るん 固定をしたら、抗原賦活化をしないとそまりませんよ。

(無題) 削除/引用 No.425-2 - 2012/04/24 (火) 15:53:10 - KT リポソームを見るためのPFA前固定なのでしょうか。もしそうでないならば、PFA前固定なしでOCT包埋はいかがでしょうか。

脾臓・肝臓におけるCD31での免染について 削除/引用 No.425-1 - 2012/04/18 (水) 10:33:59 - 内皮 いつも勉強させていただいています。 最近脾臓と肝臓の血管内皮の蛍光免疫染色を始めた博士課程の学生ですが血管が上手く染まらず困っています。 マウスの肝臓・脾臓を回収して4%PFAで12時間固定しPBSで2時間洗浄×3を行った後、15%スクロース溶液、30%スクロース溶液に交換してOCTに埋め込んでいます。染色の際は洗浄、後固定、洗浄、ブロッキングののちに一次抗体(CD31)で2時間、洗浄×3、二次抗体(IgG,蛍光緑)で1時間、洗浄×3を行っています。 脾臓では濾胞の部分はほぼバックグラウンドがない状態で抜け落ち、その周囲は全体的に染まっていてバックグラウンドと思われる状態になっています。濾胞内も染色されている部分はあるのですが血管のような管状に染まっているのではなく、点状に染まっているものがいくらか見られます。ですが、蛍光標識したリポソームを投与したマウスの脾臓では未修飾リポソームでもCD31の染色部分と完全に一致しています。見た目では何らかの細胞に取り込まれているのように見えます。免疫細胞のFcレセプターに非特異的に結合しているのかと思い、一次抗体をCD16/32抗体に変えて同様に染色してみたのですが全く異なる染色になりました。また、二次抗体の非特異的吸着も考えられたので一次抗体をFITC-CD31抗体にして二次抗体を使わずに染色してみましたがやはりリポソームと完全に一致してしまいました。 一方で肝臓では血管らしい構造は一部染まるのですがバックグラウンドが非常に強く、血管の染色との差が見えないことがよくあります。洗浄回数を3回から5回に増やしてみたのですがあまり変化がありません。 リポソームの論文や抗体販売のHPで掲載されている図では私が染色した場合と全く異なる染まり方をしており、自身の染色が上手くいっていないと認識しております。脾臓・肝臓の蛍光染色で上手く染色するためにどこを改善するべきか、どなたか御教示していただけないでしょうか。

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