Bio Technical フォーラム

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細胞境界の検出に関しまして トピック削除
No.4247-TOPIC - 2015/07/05 (日) 08:40:13 - JAG
フォーラムの皆様，
いつも参考にさせて頂いております．同一サンプルに対してISH（in situ hybridization）による転写物の検出と免疫蛍光染色（IF）による細胞境界の視覚化を試みています．対象はヒト絨毛癌由来の培養細胞で，用いているのはZO-1，E-Cadherin，Desmoplakinに対する抗体です．以下に処理の流れを表示しましたように，固定の際にTriton X-100による透過処理，ISHの前処理でProKによる抗原の賦活化をおこなっておりますが，観察する視野によりシグナルが不均一で安定したデータを得ることができません．また，３種の抗体のうちZO-1以外では全くシグナルが得られておりません．今回標的としているデスモソームなどの構造蛋白を認識させるには何か別のステップをIFのプロセスに加える必要があるのでしょうか．

皆様のご経験などをご教授頂ければ幸いです．よろしくお願いします．

Fix：PFA > Triton X-100
Pre：HCl > ProK > PFA > triethanolamine > Et-OH series
Hybri：45˚C o/n
Post：high stringency wash > RNasA > blocking > anti-DIG-POD + 上記抗体 4˚C o/n
Detection：TBST wash > anti-mIgG-AlexaFluor488 > TBST wash > TSA-Cy3 > Hoechst33342 > Sealing
　
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(無題) 削除/引用
No.4247-3 - 2015/07/05 (日) 16:45:35 - JAG
pro様、

コメントありがとうございます。先の投稿には記載いたしませんでしたが、固定と透過処理のみしたサンプルでIFを行った場合は、まったくZO-1のシグナルが得られておりません。また、ProK処理が不十分だとISHのprobeの浸透が良くない印象があります。今後、ProKの処理時間については検討いたしたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.4247-2 - 2015/07/05 (日) 10:35:03 - pro
ProK処理したらタンパク質が分解されるんじゃないだろうか

細胞境界の検出に関しまして 削除/引用
No.4247-1 - 2015/07/05 (日) 08:40:13 - JAG
フォーラムの皆様，
いつも参考にさせて頂いております．同一サンプルに対してISH（in situ hybridization）による転写物の検出と免疫蛍光染色（IF）による細胞境界の視覚化を試みています．対象はヒト絨毛癌由来の培養細胞で，用いているのはZO-1，E-Cadherin，Desmoplakinに対する抗体です．以下に処理の流れを表示しましたように，固定の際にTriton X-100による透過処理，ISHの前処理でProKによる抗原の賦活化をおこなっておりますが，観察する視野によりシグナルが不均一で安定したデータを得ることができません．また，３種の抗体のうちZO-1以外では全くシグナルが得られておりません．今回標的としているデスモソームなどの構造蛋白を認識させるには何か別のステップをIFのプロセスに加える必要があるのでしょうか．

皆様のご経験などをご教授頂ければ幸いです．よろしくお願いします．

Fix：PFA > Triton X-100
Pre：HCl > ProK > PFA > triethanolamine > Et-OH series
Hybri：45˚C o/n
Post：high stringency wash > RNasA > blocking > anti-DIG-POD + 上記抗体 4˚C o/n
Detection：TBST wash > anti-mIgG-AlexaFluor488 > TBST wash > TSA-Cy3 > Hoechst33342 > Sealing
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