BioTechnicalフォーラム [biotinラベルのISHに関しまして]

biotinラベルのISHに関しまして

No.4245-TOPIC - 2015/07/04 (土) 15:45:11 - JAG

フォーラムの皆様，
いつも参考にさせて頂いております．ISH（in situ hybridization）によりある転写物の細胞内挙動を観察しています．RT-PCRで予想されたように発現量が少なく，DIGラベルしたriboprobeの検出はチラミドシグナル増幅（TSA）でかろうじて可能になりました．同じく転写量が少ない別の転写物との因果関係を明らかにするために２重染色に向けての予備実験をしていますが，biotinラベルしたprobeをstreptavidin-HRPと反応後にTSA-Cy3で検出しようとしましたが，シグナルを得ることができませんでした．biotinラベルの場合，DIGラベルのような定量はできておりませんが，probeの希釈系列をスポットしたフィルターを用いた検出（TSA-Cy3ではなくDAB染色）では濃度に相当した発色を得られております．

DIGラベルprobeと抗DIG抗体-POD（ロッシュ）の部分以外はISHの各ステップに変更はないのですが，biotinラベルの場合には何か特別なステップが必須（あるいは禁忌）なのでしょうか．

皆様のご経験などをご教授頂ければ幸いです．以下にISHのステップを略記します．よろしくお願いします．

Fix：PFA➡Triton X-100
Pre：HCl➡ProK➡PFA➡triethanolamine➡Et-OH series
Hybri：45˚C o/n
Post：high stringency wash➡RNasA➡blocking➡streptavidin-HRP 4˚C o/n
Detection：TBST wash➡TSA-Cy3➡Hoechst33342➡Sealing
　

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No.4245-5 - 2015/07/14 (火) 20:48:32 - ぺーぺー

自分の系について言うと、どこかの論文だか技術資料だかにビオチンに適さないと書いてあったので諦めました（とはいえ、別の方からもらったプロトコルでは動いていたので条件次第なのかもしれませんが）。

記憶が曖昧なのですが、一般論としてビオチンとストレプトアビジンHRPを使用した検出方法においては……スキムミルクをブロッキング剤として使用できない。最初に過酸化水素で処理して内在性ペルオキシダーゼを失活させる事が必要がある等が注意されるべきところかとは思います。その他、最初の段階で裸のストレプトアビジンと処理してビオチンをマスクする、抗ビオチン抗体を使用するという提案を受けた事がありますが、一般的かどうかまでは知りません。

申し訳ありませんがこれでうまく行くかもしれないというような提案はできないです。

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No.4245-4 - 2015/07/11 (土) 08:40:39 - JAG

ぺーぺー様，

コメントありがとうございます．一時的にネット接続が切断されていたため返信が遅くなりました．ISHのターゲットは絨毛癌由来の細胞株をカバーガラス上で培養したものです．ISHを施行する際にはSenseとAnti-senseプローブによる実験を平行しておこなっております．Senseプローブを用いたサンプルの観察の際に，顕微鏡の減光フィルターをすべて外した状態での観察でもCy3のシグナルが見えなかったため，バックグラウンドは高くないと判断していました．ご指摘のあった”同じような実験系で実績”に関しては検討しておりません（同じサンプルではDIGによる検出がうまくいっているのみです）．今後ACTB等をbiotinで標識したプローブを作成して検討したいと思います．また，最初の投稿では省略してしまいましたが，biotinを試す前にはFITC標識を試しました（FITC標識 > 抗FITC抗体[mouse] > 抗mouse IgG抗体-HRP > TSA-Cy3 or FITC標識 > 抗FITC抗体[mouse] > 抗mouse IgG抗体-biotin > streptavidin-HRP > TSA-Cy3）．今回のbiotinラベルと同様，Senseプローブを用いた観察でもCy3のシグナルが見えなかったためbiotin標識を試したという経緯です．

ぺーぺー様におたずねしたいことがあるのですが，内在性のbiotinがノイズの原因であった場合，どのように対処されたのでしょうか．やはり何らかの不活化処理をプロセスに追加されたのでしょうか．お時間がございます時にお教え頂ければ幸いです．よろしくお願いします．

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No.4245-3 - 2015/07/09 (木) 21:59:47 - ぺーぺー

対象としているサンプルについて情報がないので何とも言えないのですが、つかっているサンプルによっては内在性のビオチンがノイズとなってろくにシグナルが見えない場合があるらしいです（経験者）。そのサンプルについては同じような実験系で実績があるのでしょうか？それと、fluoresceinのような別の標識を使うのは選択肢としてはありませんか？

(無題)

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No.4245-2 - 2015/07/04 (土) 15:51:12 - JAG

プロトコルの部分見づらいので修正します．

Fix：PFA > Triton X-100
Pre：HCl > ProK > PFA > triethanolamine > Et-OH series
Hybri：45˚C o/n
Post：high stringency wash > RNaseA > blocking > streptavidin-HRP 4˚C o/n
Detection：TBST wash > TSA-Cy3 > Hoechst33342 > Sealing

申し訳ありませんでした．

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No.4245-1 - 2015/07/04 (土) 15:45:11 - JAG

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