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(無題) 削除/引用 No.4235-20 - 2015/07/16 (木) 21:14:42 - た （続き） また、PCRさんが仰られるように検量線はcDNAでやるべきです。程度の差はあれ、cDNAは高濃度側では増幅効率が悪く、低濃度側では増幅効率が良くなることがあります。この場合、直線性がある部分のみを検量範囲にします。 （直線性ですが、R^2が0.999を下回る場合Failedと判定する〜判定自体しないなど、機器によって様々です。ガイドライン上はとりあえず論文中に明記しとけばいいです） サンプルは逆転写物をこの直線内に入るように希釈します。こうすることで、cDNAの中にPCR阻害物があろうと、それがサンプルより多い部分〜少ない部分で直線性を確保しているので、現状最も正しいです。 （東大の例でいうならTime0は未希釈のものから検量線の希釈段階を取っているだけで、検量線から外れているとは限らないのでは？普通サンプル希釈するし） リアルタイム開発者のRocheや実験参考書あたりには昔からcDNA Standardが書かれていますが、臨床検査やウイルス研究の人たちからすると何pgとかの検量線の方が馴染みが深いようです。細胞数とか遺伝子発現量の変化とか気にしてないですからね。 そこらへんもあり、ガイドライン上はプラスミドでもなんでもいいことになってますので、サンプル汚いけど綺麗な検量線引いて論文通したい人は（面倒な）そっちのやり方を選ぶのではないでしょうか。臨床とVitro実験を同じガイドラインにまとめてこう中途半端になっただけなんですけどね 個人的にはReferenceで補正しているのに何コピーとか書いている人見ると何だか恥ずかしいです 先日アジレントのセミナーに行った時、cDNA希釈系列ではなくPCR産物を検量線に使われていたので質問したのですが、「cDNAで検量線を引くと絶対歪むから」と仰られていました。要するに増幅効率の違い＝大きな誤差は承知済みってことです。個人的にはそんなサンプルなら実験しなきゃいいのにと思いますが、ここは人によるのでしょう プライマーは自分で設計し経験を積まれることをおすすめします。 例えばちょっと違和感のある論文に載っていたTNF-αのプライマーを先日使ってみたところ、増幅効率は普通で立ち上がりが非常に悪く、通常サンプルだとCt=43程度でした。 �刧僂tを使っている論文で検量線の記載もなかったので、コントロールでわざと小さく出るようなプライマーを選び、実験結果（誘導倍率）を大きく見せたのかもしれません。（PCRガイドラインも論文が酷すぎて出てきたわけで） そういうこともあるので、プライマーの設計くらいは覚えたほうがいいですよ

(無題) 削除/引用 No.4235-19 - 2015/07/16 (木) 21:07:32 - た いくつか意見を書かせて下さい。 まずリアルタイムさんは一つ勘違いされていると思います。 �刧僂t法（リバック）の場合、「検量線を引かなくていい解析法」がメーカーサイドの「売り」ですが、 �@「増幅効率100％」をサンプルCt値付近で確保し、 �AReferenceとtarget間に大きなCt値差があってはいけません。 �@のためにどちらにしろ検量線が必要です。これは実験参考書にも昔から書いてありますし、そもそもリバックさんも「検量線を一度も引かない」なんてことは言っていません。 その同僚が一度も確認していないのなら、完全な知識不足・実験ミスです。 「殆ど100%」の基準は90−110%です。プライマーを作りなおした方がいいです。（これは検量線を引いて増幅効率を加味するパッフルの�刧僂t法でも満たさなければならない（BioRadなど）満たさなくていい（Agilentなど）どっちの意見もあります） 検量線を一度も引かず、増幅効率の確認をしなければ、PCRガイドラインを満たせません。それでも通る雑誌はありますが。。。 個人的には「検量線を引かない検量法」ってそもそも何なのかなと思います �Aの目安は3−5程度だったかと思います。 ＞見たい遺伝子全てが1 plateに乗らない場合 方法として、plate間の補正を行うキャリブレーターを置くという方法があります。他の方が指摘されるようにRun毎に増幅効率など変わりますので、できれば、1plate上にtarget、Referenceがあればより綺麗ですが誤差の範囲です 検量線を毎回引かない場合は、最初に3回引きます。その増幅効率平均値を使用して�刧僂t（パッフル）します。論文には代入した増幅効率とCV値を書いとけばいいです。お金がなかろうが、論文投稿するならこれはやれよ、と思います 「検量線を引いたからといってどこまで正確なのか」という意見がありますが、経験から言わせていただくと、天と地の差があるほど正確です。 もちろん、きちんと実験できる技術がある場合です。 これは「PCRが増幅させる反応である」ことを思い起こして頂ければなっとく頂けるかと思います。（ReferenceとtargetのCt値が近い方がいいのもこのためです） おおさんも指摘されているようにStandardを引く方法はReferenceで補正されている限り「絶対定量法（qPCR）による相対定量」です。 補足しますと、検量線に何ngとか何コピーとか書いてあろうが、抽出したRNAが細胞数いくつぐらいなのか分からない限りReferenceで補正しますので、結局検量線の単位も消えます。なので、絶対定量ではありません。 （要するに検量線がcDNAで単位がrelativeでも結局同じ）

(無題) 削除/引用 No.4235-18 - 2015/07/08 (水) 04:06:16 - リアルタイム PCRさん お返事いただきありがとうございます。 おっしゃる通りです。例えば分化マーカーを見る場合、後期分化に重要な遺伝子は前半では全く発現していないため全てを混ぜて検討すると検量線に乗らないことがあると思います。 こんなことを言うと叩かれるかと思いますが、そこまで細かく考えてやってる人は結構少ないかと思います。。。私が言うのはお門違いかと思いますが。。。 東大某ラボでは確かtime 0のサンプルをstandardにして検量線を引くそうです。ですので時間経過とともに発現の上がる遺伝子は検量線から漏れているはずです（そこまで聞いていないので実際は乗っている可能性もないわけではありませんが）。 qPCRに関してもっと考えて実験すべきだと思いました。 たくさんの意見が聞けて本当に勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.4235-17 - 2015/07/08 (水) 03:50:55 - PCR リアルタイムさん >増幅効率がtemplateと同じかどうかは調べていませんが、Reverse transcriptionまでは全て同じ日に同条件で行っており、また全てのcDNAを混ぜているので極端に増幅効率が異なるということは考えていませんでした。 リアルタイムさんと似た感じの実験で同じやり方でqPCRやっていた別の知り合いがいるのですが、同じサンプルをラボの別の人がΔΔCt methodで計測した結果と比べたところ、ターゲットの発現が高くなるところでデータがズレることに気付き、検証の結果、その検量線では発現が高くなるところでは使えないことに気付いてました。リアルタイムさんの場合はどうかわかりませんが、"全てのcDNAを混ぜ"て作ったもので検量線を引くと起り得る例です。 私の知識も足りないので補って欲しいのですが、発現量の少ないものも多いものも全て等量混ぜて、それを段階希釈したもので検量線を引きますよね? この場合、希釈無しのもっとも濃い濃度でも、発現量の最も多いサンプルより低い量のターゲット遺伝子しか含まれていないですよね。 なので発現量の最も多いサンプルというのは検量線の枠外になってしまうので、検量線の妥当性の検証が必要になると思うのですが、どうでしょうか? 最も多いもののみならず、サンプル間の発現量の組み合わせによっては、かなりの数のサンプルが検量線の枠外という可能性だって理屈上はある訳で。 まあ、実際には問題にならない場合があるだろうとは思いますけどね。 検量線を引いたら、それを見て、サンプルは更に10倍とか希釈してからqPCRにかけることがあるだろうし。ただまあ、問題になる場合もあるので、検量線は、発現量の最も多いサンプルを段階希釈して作る方が理にかなっているように思います(しかし、サンプル全てを等量混ぜて段階希釈したもので検量線を引くのはかなり一般化している印象があります)。 >申し訳ありませんが「適切な検量線を引くための予備実験に時間をかけ」とありますが漠然としててよくわかりません。もしよろしければ詳しく説明してください。 すいません。事情があって、この知人が具体的にやったことは詳しく書けません。その詳細を書いて、リアルタイムさんも同じようにやるべき、と言っている訳でもありません。

(無題) 削除/引用 No.4235-16 - 2015/07/08 (水) 01:26:39 - リアルタイム PCRさん standardはその実験で使用するcDNAを使用しています。 具体例を挙げると、薬物刺激ありなしでタイムコースを取ったサンプルがあるとすればその全てを等量混ぜて段階希釈したものををstandardとして使用しています。 ですので別の実験で使用したcDNA等は使用していません。 増幅効率がtemplateと同じかどうかは調べていませんが、Reverse transcriptionまでは全て同じ日に同条件で行っており、また全てのcDNAを混ぜているので極端に増幅効率が異なるということは考えていませんでした。 >どうしても(出来る限り)正確な発現量の比をqPCRで知る必要があった知り合いは、適切な検量線を引く為の予備実験に時間をかけ、最終的に、PCR産物を精製したものを、その遺伝子を発現していない状態のサンプルを取ってくる細胞から作ったcDNAと混ぜた上で使うと、かなり正確にサンプル内での発現量を反映するデータが出せることを見いだしていました。リアルタイムさんの実験でここまでやる必要があるかどうかわかりませんが、しっかりとより正確な手法で解析するには、"検量線を引くべき"ではなくて、"適切な検量線を引くべき"だと思います。 申し訳ありませんが「適切な検量線を引くための予備実験に時間をかけ」とありますが漠然としててよくわかりません。もしよろしければ詳しく説明してください。 コメントしていただいた皆さまのリアルタイムPCRに関する考え方は同じなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4235-15 - 2015/07/08 (水) 00:16:43 - PCR >[Re:10] 独り言さんは書きました : > 絶対定量とはいっても、standardをプラスミドで準備して、サンプルを細胞からのtotal cDNAなどを用いているのであれば、total cDNAの場合はプライマーが非特異的な結合して、PCR効率が全く同じようにおこるという保障はないので、絶対定量と言えども完璧ではありません。 > > やっぱりこれありますよね。 この掲示板だったか別の掲示板だったかで、プラスミドではPCRできるプライマーがcDNAでかからないのでPCRのコンディションをどう変えるべきかという質問があり、レスの多くはtemplate DNAが変わればPCR効率が変わるのは当たり前だからコンディションを変えるよりcDNAでワークするプライマーをデザインするべき、でした。プラスミドとcDNAではPCRのかかり具合が違う、は結構きちんと認識されている訳です。 にもかかわらず、多くの人が絶対定量のstandardに使うのがプラスミドだったりしてなんだかなあ、という気がしています。プラスミド以外だと、PCR産物をゲルから切り出して精製したものだったりするけれど、これもやはりPCR効率はcDNAと違うでしょうね。 もちろん、そこをきちんと検証した上でstandardに使うのは問題無いと思うのですが、そこまでせずに"単に混ぜてPCRをかけて出てきた結果をグラフ化するという単純な"やり方をしている人の方が多いのが現状のようです。 リアルタイムさんはstandardには何を使われているでしょうか? standardとcDNAでPCR効率が同じであることは確かめられているでしょうか? もしもこれが無いと、不適切な検量線に依存したデータ故にΔΔCt methodよりも不正確なグラフになることもありえると思います。 どうしても(出来る限り)正確な発現量の比をqPCRで知る必要があった知り合いは、適切な検量線を引く為の予備実験に時間をかけ、最終的に、PCR産物を精製したものを、その遺伝子を発現していない状態のサンプルを取ってくる細胞から作ったcDNAと混ぜた上で使うと、かなり正確にサンプル内での発現量を反映するデータが出せることを見いだしていました。リアルタイムさんの実験でここまでやる必要があるかどうかわかりませんが、しっかりとより正確な手法で解析するには、"検量線を引くべき"ではなくて、"適切な検量線を引くべき"だと思います。

(無題) 削除/引用 No.4235-14 - 2015/07/07 (火) 16:51:41 - リアルタイム みなさんお返事いただきありがとうございます。 リアルタイムの奥深さと言いますか、単に混ぜてPCRをかけて出てきた結果をグラフ化するという単純な考えでは間違ったデータの解釈につながるということがよくわかりました。 おおさん >検量線をひいても検量線に使ったものが、なんコピーあるか、あるいはターゲットの配列としてなんナノグラムあるかわかってなければ相対定量と思うのですが、、、そこで話がややこしくなってませんか、、、 そうですね。既知量のtemplateを使用していないと絶対定量とは言えませんね。 話をややこしくしてすみません。 >あとinternal controlとtargetでPCRの効率が違えばΔΔCt methodでは変になると思いますよ。たとえば全く同じ発現量のサンプル間でなんかの都合で効率が100%のinternal controlのCtが1ずれたとき、アプライした量が一方の半分だけど、targetのCt値は1ずれないですよね。なのでそんな状況では同じ発現量でもqPCRでは違う発現量にみえてします。 検量線をとるか、internal controlが同じCt値になるように調整してからtargetのCt値を比較すれば何倍かはいえなくても量が多い少ないがいえるとは思います。 Ct値が同じなるように調節するということは何度かPCRをかける必要が出てくると思うので効率的ではないような気がします。やはり検量線を取るべきかと思いました。 >あと効率が150%という記述があったのですが、こういう場合って系がワークしてないと思うのですが、、、そんな場合でもqPCRやっちゃうもんなんですか? いえ、当然これはまずいと思っています。 ラボを移ってからワークすると言われたprimerを使用してこのような結果が出ているので一度ボスやスタッフと相談すべきだと思っています。 このprimerはある薬物を処置すると遺伝子発現が落ちることが知られているのですが、150%の増幅率で得られたデータをグラフ化しても同様の結果が得られたため、おそらく増幅効率等はあまり気にしていなく（もしかすると見てすらいないかもしれません）、結果がもっともらしいためワークすると考えているようです。 やはりタイムコースをとって遺伝子がどの時間でどれくらい落ちたかをしっかりとより正確な手法で解析するには検量線を引くべきかと思いました。 全体としてボロボロな実験を露呈する形となりただただ恥ずかしい気持ちでいっぱいではありますが、大変勉強になりました。本当にありがとうございます。 またコメント等ありましたら皆様よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4235-13 - 2015/07/07 (火) 16:13:48 - おお あと効率が150%という記述があったのですが、こういう場合って系がワークしてないと思うのですが、、、そんな場合でもqPCRやっちゃうもんなんですか?

(無題) 削除/引用 No.4235-12 - 2015/07/07 (火) 16:11:43 - おお >検量線をとるか、internal controlが同じCt値になるように調整してからtargetのCt値を比較すれば何倍かはいえなくても量が多い少ないがいえるとは思います。 あ、検量線を引けば何倍かはいえますね(私の考えている相対定量はできるということです)。

(無題) 削除/引用 No.4235-11 - 2015/07/07 (火) 16:07:56 - おお 検量線をひいても検量線に使ったものが、なんコピーあるか、あるいはターゲットの配列としてなんナノグラムあるかわかってなければ相対定量と思うのですが、、、そこで話がややこしくなってませんか、、、 それと例えばPCR効率が低くて実際に何倍かどうかいえないならば相対的数字もでないのだから相対定量といえませんよね。別にそのやり方を否定してませんが、なにかどの様に書いたら皆さんと共通の認識で話ができるのかと、、、 あとinternal controlとtargetでPCRの効率が違えばΔΔCt methodでは変になると思いますよ。たとえば全く同じ発現量のサンプル間でなんかの都合で効率が100%のinternal controlのCtが1ずれたとき、アプライした量が一方の半分だけど、targetのCt値は1ずれないですよね。なのでそんな状況では同じ発現量でもqPCRでは違う発現量にみえてします。 検量線をとるか、internal controlが同じCt値になるように調整してからtargetのCt値を比較すれば何倍かはいえなくても量が多い少ないがいえるとは思います。

(無題) 削除/引用 No.4235-10 - 2015/07/07 (火) 15:16:04 - 独り言 どちらの方でも、条件が整っていれば、またその結果から何を示したいのかが十分であれば、どちらの方法でもよいと思います。 個人的には、見たい遺伝子数が例えば5個あったら、5個分も検量線を毎回作るのは大変だし、２−３プレート分になったら手間もかかるし、そもそもqPCRは1サンプル100円ぐらいかかるから貧乏ラボなら、節約したいし。お金がなくなって実験できないより、必要な最低限の実験を限りある限り行う方が手間もお金も節約できるし。そういう場合は相対定量の方で十分。 ノックダウンを評価する場合は、どのsiRNAが一番効くかどうかだけで十分であれば相対定量で十分だし、20%なのかもしくは10%まで下がるかみる必要性があるのであれば絶対定量の方がいいだろうし。でも結局はこの場合、どちらの方法でも最終的にはサンプル間の倍率を知ることができればいいので、個人的にはこの場合はどちらでも同じようなもんだと思う。 ちなみにPCRさんもおっしゃってますが、絶対定量とはいっても、standardをプラスミドで準備して、サンプルを細胞からのtotal cDNAなどを用いているのであれば、total cDNAの場合はプライマーが非特異的な結合して、PCR効率が全く同じようにおこるという保障はないので、絶対定量と言えども完璧ではありません。

(無題) 削除/引用 No.4235-9 - 2015/07/07 (火) 10:56:47 - taq どっちがどうとかいうことではなくて、 その方法で適切な結果を出す為に必要な条件 それが満たされない場合に起り得ることと最低限言えることの範囲 自分が示したいことに必要な範囲 その実験を行うことの実現可能性 で判断するだけのことじゃないですか？ 適切じゃない方法でとんちんかんな結果が出てくる可能性がある ことを知っといて 世の中にはそれを知らずにやらかす人がいるよねーと思って人の結果を見る だから、この人のこの方法おかしくね？！？と言われても それで十分でおかしくないこともあるし、それは困ったことだね、ということもあるのでなんとも言えない。 qPCRは、幸か不幸か「想像で補わなきゃいけない範囲」が広い方法になっちゃった感がありますね・・

(無題) 削除/引用 No.4235-8 - 2015/07/07 (火) 03:39:16 - PCR ちょっとリアルタイムさんの聞きたいところと別の話になりますが、検量線法ってどこまで信頼できるメソッドでしょうか? 検量線法を行われている方々は普段、standardとサンプルとで増幅効率が同じであることはきちんと確かめられていますか? 確かめなくてもよいものなんでしょうか? 私のラボの周りではそこまで調べている人は皆無でした。 で、別のところでたまたまそういう例を見たのですが、standardに使うDNAでは増幅効率がほぼ100%、サンプルのDNAではこれが85%位に落ちている、というのを見たことがあります。サンプルDNAがクリーンでなかったからなのか、standardに使うDNAがサンプルDNAに比べてクリーンすぎるのか、まあとにかくそういうデータでした。 このことを考えると、"有意差があるとか、他の刺激に対してどれくらい変化しているかを見る"場合に、ΔΔct methodよりも検量線法の方が適していると言い切れるかどうか、と思っているのですが。

(無題) 削除/引用 No.4235-7 - 2015/07/06 (月) 23:47:47 - リアルタイム 独り言さん コメントいただきありがとうございます。 おっしゃるように、出来る限り同じプレートで目的遺伝子とハウスキーピングを見るべきですね。私自身、ラボでは同一プレートでなくていいと教えられたのでそのような実験はやってきませんでした。しかし、今後研究する上では非常に重要な事だと思い、出来れば今後の実験では同一プレートで実験を行っていこうと思っています。 この点は理解いたしました。 ただ、相対定量と絶対定量のどちらを採用するかついては少しわかりにくく、私の実験にはどちらの方法が良いのか今ひとつよくわかりません。絶対定量の方が正確ならそちらでやればいいと思うのですがいかがでしょうか？ ある刺激もしくはノックダウンによる遺伝子発現変化をタイムコースで確認する場合、絶対定量の方が良いという考えでよろしいでしょうか？またこの場合、相対定量ではいけないという根拠はありますでしょうか？ 単にある刺激に対して目的遺伝子が"どう動くか"を見る場合、特に正確な上昇率を見ているわけではないのでΔΔct methodでOKだと思います。ただその際、有意差があるとか、他の刺激に対してどれくらい変化しているかを見るにはΔΔct methodでは不適切だと思っています。 理解が悪くご迷惑をおかけしますがコメントいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4235-6 - 2015/07/06 (月) 22:08:15 - 独り言 どちらがより正確なデータかといえば、standardをおいた方だと思いますが、どちらの方法を用いるかは実験によるでしょう。 たくさんサンプルある場合は相対定量の方が楽だし、サンプル間の遺伝子発現の上下関係を知りたいだけであればそれで十分。 絶対定量は、目的産物の濃度が重要とか、サンプル間の正確な発現倍率がとても重要なときに使うことになると思う。 どのような実験をして、どのようなことを示したいのかが重要であって、それが満たされるのであればStandardなくってもいいでしょう。 あと、私的には絶対定量のStandardも相対定量のハウスキーピング遺伝子も常に同じプレートにすべきだと思っております（可能な限り）。PCRマシーンが同じプログラムでも毎回100%同じ温度変化をしてくれるのか保証はないし、そこにブレがあれば、それが誤差となるし。

(無題) 削除/引用 No.4235-5 - 2015/07/06 (月) 21:16:32 - リアルタイム おおさん コメントをいただいているのにお返事が大変遅くなり申し訳ありません。 自作もしくはpublishされた論文から引用したprimerを利用しているので増幅効率についてはわかりません。 先日PCRをかけたところGAPDHはほぼ100%(実際は98%)でしたが、目的の遺伝子は85%、150%でした。 ΔΔCt methodでは増幅効率がハウスキーピングと目的遺伝子で同等でないと使えません。 要するに何倍に増加/低下してるという議論ができないということだと思います。 よってstandard curve methodを使用すべきだと考えているのですがこの考え方にまちがいはないのでしょうか？ もう一つ質問よろしいでしょうか？ 見たい遺伝子全てが1 plateに乗らない場合は皆様どうなさっていますか？ 見たい遺伝子が多数あり、タイムコースを取っているとどう考えても1 plateにのりません。 一度確認したハウスキーピングは別のプレートで確認した目的遺伝子と割り算してグラフ化してもいいのでしょうか？ standardを同じものを使っていればプレート間の比較も可能だとコメント欄で見たこともありますが、それを踏まえるとハウスキーピングは別の遺伝子を見る際に再度確認する必要がないわけですが、実験上本当に問題がないのか教えて下さい。 皆様のお考えをいただけると大変助かりますのでどうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4235-4 - 2015/07/02 (木) 11:20:08 - おお わたしはqPCRしない派なので。 最近は効率が95%以上と確認されたプライまーセットを業者が売っていて、それを使ってやっているので一応OKという事でやっているところが多いんじゃないかと。ただPCRの酵素を含めた各社qPCR mixの特性、PCRマシーンなどで若干変わることもあるので、手元の系で一度確かめた方がいいかとは思います。 本当なのかどうかはよく発現しているサンプルを1/4とか希釈してCt値が2ずれるかとか確認すればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4235-3 - 2015/07/02 (木) 10:00:39 - リアルタイム おおさん おおさんは引いていますでしょうか？ ΔΔCt methodで算出するのであれば増幅効率が100%近くないといけないようですし、そうなると使えるプライマーは割と限られてくると思います。 私としてはstandard curve methodでやるべきだと思っています。 ラボによると言われればそれで終わりですが。。。 standard curve methodでサンプル数が多い時96well plateに収まりきらないことがあると思いますが、その際、２枚に実験を分けると思います。 それぞれのresultsをまとめてグラフにする際、ノーマライズする必要があるのか、あるのであればその具体的な方法について教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4235-2 - 2015/07/02 (木) 07:43:33 - おお 検量線引かないでやっているラボもあると思います。

リアルタイムPCRでのデータの解析について 削除/引用 No.4235-1 - 2015/07/02 (木) 01:47:55 - リアルタイム リアルタイムの実験について正しい方法を教えてください。 現在リアルタイムPCRを行なっており、同僚の結果を見たところStandardを置かずにPCRをかけて結果をグラフ化していました。 私は毎回、Primer毎にstandardを置いて実験していたため、新たなラボでは正しく実験が行われていないと思いました。 そのためリアルタイムの解析について調べたところ「検量線法」と「相対的Ct法」というものがあり、 「検量線法」は毎回standardが必要であること、 「相対的Ct法」はstandardを置く必要が無いが、増幅効率がほぼ100%でないといけない といったことがいくつかのメーカーの説明書に書いていました。 これまでStandardを置くことが必須と思っていたので、置かずにやっていた同僚の結果は本当なのだろうかと疑って見ていました。 経験豊富な皆様のご意見を伺いたいのですが、どちらの方法が良いのでしょうか？

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