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(無題) 削除/引用 No.4226-16 - 2015/07/02 (木) 14:43:55 - gproteincl Tris-tricine系の組成の記載に誤りがありました。 Stacking gelとSeparate gelの組成をすっかり入れ替えて読んで下さい。 正しくは Stacking gel: 3% Acrylamide/ 0.75 M Tris-HCl, pH 8.45 Separate gel: 6% Acrylamide/ 1 M Tris-HCl, pH 8.45/ 10% Glycerol です。誤りがあったのは、書き込みだけで実験は正しい組成で行っております。

(無題) 削除/引用 No.4226-15 - 2015/07/02 (木) 13:11:06 - gproteincl もう一度、Tris-tricine系で泳動してみようと思います。BN-PAGE用のサンプルバッファーをスクロースで調整してみようかな。 アクリアミド濃度をもっと薄くしたほうがよい気がするので、2.5%-7%くらいの グラジエントにしようと思います。Tris-tricine系の場合、Stacking gelもSeparate gelもpHが共通なので、単純に2.5%-7%のグラジエントのゲルでStacking gelを重層せずに泳動時間を長くして試してみます。

(無題) 削除/引用 No.4226-14 - 2015/07/02 (木) 13:01:12 - gproteincl おお様 >泳動距離に影響を与えるパラメーターがおおい ターゲットの蛋白質のバンドはある程度分離が悪くなることは覚悟しております。 使用しているマーカーのマニュアル: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/NativeMarkUnstainedProteinStnd_man.pdf マニュアルに記載されている 66kDaと480kDaのバンドが、私の泳動結果では正方形になるほど分離が悪い(他のバンドは健闘しています)です。そのため、サンプル由来ではなく、バッファーかなと思っていました。このメーカーの電気泳動系がよほどよくできているだけのことなのかもしれません。写真はBN-PAGEで得られた像と思われます。メーカーによると、Native-PAGEでも使えるということでした。 >Tris-tricineのバッファーで >running gelのTris-HCl (pH8.8)を375mMから600から750mMに上げる >ゲルにグリセロールを10~20%加える Tris-tricineはtricineがglycineよりも移動し易いので低分子もセパレートゲルで追い越されて分離されるようになる、と理解していましたが、高分子の分離にも効いてくるのでしょうか。むしろ、glycineよりも遅い代役があればいいのかな(スタッキングゲル内でもglycineが蛋白質より移動し易いせいかもしれない)とも思っていたのですが。 と言いつつ、Tris-tricine系のプロトコルを確認してみると、Separate gelに10% Glycerolが入っているし、Tris bufferもglycine系より濃いと思い(同時に複数条件を変更するのは憚れましたが)やってしまいました。 どこまで一般的か分からないので、一応、組成を記載します。 Cathode running buffer: 0.1 M Tris-Tricine, pH 8.3 Stacking gel: 6% Acrylamide/ 1 M Tris-HCl, pH 8.45/ 10% Glycerol Separate gel: 3% Acrylamide/ 0.75 M Tris-HCl, pH 8.45 Anode running buffer: 0.2 M Tris-HCl, pH 8.8 >blue-nativeのようにCBBを使う Sample bufferは通常のNative-PAGE用のものと、BN-PAGE用のものを使用しました。BN-PAGE用のものは、Glycerolで比重を稼いでいるので、アプライした段階でメニスカスがひどかったです。 泳動結果は、蛋白質サンプルはSeparate gelに入ったばかりという状態で分離のほどは不明です。これは、おっしゃる通りTris濃度が大きいからか、泳動時間が足りなかったからだと思います。マーカーは綺麗に流れてはいますが、Separate gelに入ってからあまり移動していないのでなんともいえません。すべてのバンドが見えているわけではありません。しかし、66kDaのバンドは現状の泳動距離だと綺麗です。

(無題) 削除/引用 No.4226-13 - 2015/07/02 (木) 12:41:27 - gproteincl AP様 >分子ふるい効果のないウェル中を泳動されている ターゲットの蛋白質(マーカーも含めて)には400kDa以上の位置に泳動されるものもあります。Stacking gelのアクリルアミド濃度は3-4%付近が相場かと思うのですが、この場合、「分子ふるい効果のない」と言うことは難しいですよね。といっても、これ以上濃度を下げるとゲル化が難しくなりそうです。 >等電点の高いタンパク質を狙うときはpHを下げる あまり下げるとGlycineがほとんど泳動されなくなるような。どれくらい下げるといいのでしょう。ターゲットの蛋白質のpIはNativeの状態では分かりません。等電点電気泳動をしてみれば分かるのでしょうか。変性状態というか、配列から計算すると、サンプルには5.8, 5.5, 4.8の三種類の蛋白質が含まれています。Native状態だとpIが大きく変わるということもあるかもしれないので、試してみる価値があるかもしれません。 >スタッキングゲルがあるタイプのゲルでしょうか >非変性条件ではSDS-PAGEと同等のスタッキングやバンドのシャープさ セパレートゲル/スタッキングゲルともに自作で重層しています。 Native-PAGEはSDS-PAGEよりもバンドが綺麗でないということは一般論としては聞き知っていましたが、各メーカーがprecast gelで出している写真などを見ると、結構いけるものだなと思い取り組んでおります。過去のトピックでもありましたが、やはり自作とprecastだと埋められない差があるのだろうかと感じています。

(無題) 削除/引用 No.4226-12 - 2015/06/30 (火) 23:42:34 - おお tris-tricineの系はpHがすタッキングゲルとおなじ(バッファー濃度がうすいだけ)なので、わかりやすいとはおもいます。ただpHは8.45だったので塩基性の蛋白はpH8.8より流れにくいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4226-11 - 2015/06/30 (火) 23:00:52 - おお SDSの代わりの蛋白につく負電荷をもつものを添加すると解像度がよくなるみたいです。この原理はblue nativeで応用されてますが、どなたか通常のtris-glycineでやって改善されたという人がいたような気がします。blue-nativeのようにCBBを使うか、比較的マイルドな界面活性剤で負電荷をもつdeoxycholateなどが思いつきますが。ただdeoxycholateはpH7以下では沈殿するので、、、ph6.8のupper gelとサンプルバッファーはどうだろうか、、、

(無題) 削除/引用 No.4226-10 - 2015/06/30 (火) 11:44:14 - AP >非変性条件での電気えいどうで開発されたシステムですよね。 それもそうだわねえ。 ひょっとすると、サンプルバッファー、スタッキングバッファーのpHをもっと下げると効くかもしれない。 ちょっと古い教科書を見直したら、等電点の高いタンパク質を狙うときはpHを下げるということも書いてありました（標的タンパクの等電点の推定値は分かっているのでしょうか）。 それと、確認ですが、スタッキングゲルがあるタイプのゲルでしょうか。 市販のゲルだと、スタッキングゲルがなくて、サンプルバッファーだけでスタッキングさせるものもありますし。

(無題) 削除/引用 No.4226-9 - 2015/06/30 (火) 10:37:19 - おお SDSPAGEのtris-glycine のバッファーって非変性条件での電気えいどうで開発されたシステムですよね。

(無題) 削除/引用 No.4226-8 - 2015/06/30 (火) 10:05:25 - AP SDS化しない非変性条件で不連続バッファ系によるスタッキングを期待するのは妥当ではない気がします。 不連続系ではグリシンがスタッキングゲル中のpH6.8では負電荷を失い、分離ゲル中のpH 8.0で電離して負電荷を帯びるけれど、 SDS化されたタンパク質はpHが低くても高くてもSDSの電離状態は大差なく、安定した負の電荷を帯びているということでスタッキングが起こると理解すます。 しかし、SDS化されていなければその電荷は（グリシンと同様に）バッファのpHに影響され、しかもタンパク質ごとの等電点のちがいによってまちまちです。 むしろ、昔ながらの連続バッファー系でやって、ロードの時にサンプルの厚みを抑える（サンプル体積を極力抑える。泳動バッファーと混じって体積が増えるないように静かにロードする）ようにしたほうがいいんじゃないでしょうか。また、ゲルに侵入する前、分子ふるい効果のないウェル中を泳動されているときにある程度、濃縮がかかるはずです（この点がpH 6.8では効果が薄くなっているかも）。 結論としては、非変性条件ではSDS-PAGEと同等のスタッキングやバンドのシャープさを求めるのは、ないものねだりかも。

(無題) 削除/引用 No.4226-7 - 2015/06/30 (火) 05:13:35 - おお Tris-tricineのバッファーでやるとどうかなぁ。。。やっている文献とか人とか見たことないけど。。。

(無題) 削除/引用 No.4226-6 - 2015/06/30 (火) 03:23:47 - おお それと温度によるpHの違いを気にしているようですが、SDSPAGEでもたまによく冷えた状態で流すこともありますので、全体的にはそんなに影響ないとおもいます。ただ個々のターゲットの特性によっては改善するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4226-5 - 2015/06/30 (火) 00:17:28 - おお バッファー系はあまり関係ないと思います。nativeでは、構造のフレキシビリティーやバリエーションとかコンプレックスの安定性とかいろいろ泳動距離に影響を与えるパラメーターがおおいいのだとおもいます。だからSDSPAGEより分解能がわるいこ事がよくあります。 わたしはSDSPAGEで分解能を上げるときにrunning gelのTris-HCl (pH8.8)を375mMから600から750mMに上げることがあります(濃度が高い方がサンプルの流れ方が遅くなるのでよりすタッキングがかかるのだとおもう)。またもしかしたらゲルにグリセロールを10~20%加えると改善されるかもしれません。すタッキングゲルのほうはいじらないでいいのではないかとおもいます。特にグリセロールいれるとサンプルがのせづらくなりますし。 あとはサンプルにDTTを加えれるなら入れてみてもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4226-4 - 2015/06/29 (月) 19:28:28 - gproteincl おお様、AP様 ご指摘ありがとうございます。 マーカーはすでにグリセロールが入っているので、サンプルに加えるローディングバッファをグリセロールからスクロースに変更しました。 AP様の対処法にも注意を払いながら、マーカーとサンプルを泳動しました。 マーカーのバンドの形状は改善して、長方形のように見えます。多少、両端が濃くは見えますが、ダンベル様ではありません。 しかし、形状は変わったものの(あるいは形状が変わったことで)、バンドが電界に対して平行方向に広がっている(バンドが厚い)ことが目立ちます。とりわけ厚く見えるバンドは、マニュアルに記載されているバンドの写真でも濃く厚く見えているので、含有している蛋白質の量が多いのだろうと思います。ある程度は許容できるのですが、私の得たバンドはあまりに厚いです。(正方形に近い) Stackingが上手くできていないのだろうか、と考えているのですが、どう思われますか。 各Tris bufferのstock溶液のpHを確認しましたが問題ありません。各bufferを作り直してみようとは思います。(泳動時は4度なので、bufferは4度で目的のpHになるように調整すべきでしょうか。普段は室温でSDS-PAGEを行っているので、室温で調整しています。) 普段のSDS-PAGEは綺麗に流れています。現在泳動しているNative-PAGE系のRunning bufferにSDSを適量加えただけです。SDSを抜いた分、Glycineを多めに入れてみるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4226-3 - 2015/06/29 (月) 13:36:33 - おお わたしもグリセロールがあやしいとおもうな。

(無題) 削除/引用 No.4226-2 - 2015/06/29 (月) 12:49:36 - AP >dumbell shapedあるいはU-shapedと表されるような形になります。 これは、サンプルをロードしたときにメニスカスを生じ（両端がウェル壁にそって立ち上がって、中央が凹む）、そのまま泳動されるためでしょう。タンパク質、アクリルアミドスラブゲル、に限らず核酸、アガロースサブマリンゲルでも起こりえます。 対処法としては、 ・サンプルをロードしてからすぐ泳動を始めずに、5-10分落ち着かせてから始める。拡散によってサンプルの分布が均衡化される。 ・ローディングバッファーの比重付けをグリセロールのような粘性の高いものではなく、ショ糖などの粘性の低いものにする。粘性が低いほうがメニスカスを生じにくい。 ・サンプルが泳動バッファーとなるべく混じらないよう、かきたてないよう、ウェルの底から静かに積み上がって行くようにロードする。雑にロードするとかきたてられたサンプルがウェル壁を這い登ってメニスカスが大きくなる。

Native-PAGEのバンドがぼやける 削除/引用 No.4226-1 - 2015/06/29 (月) 11:07:38 - gproteincl 過去のトピックも参考にして条件検討してみたのですが、改善されないので相談させてください。 Native-PAGE用のマーカー(life technology)をLaemmli系からSDSを抜いて電気泳動しています。得られるバンドはレーンの両端にたんぱく質がよっていて、dumbell shapedあるいはU-shapedと表されるような形になります。 Native-PAGEのトラブルシューティングなどによると、オーバーローディングが疑われるとのことですが、推奨される量より十分に少量をアプライしています。 目的のたんぱく質を泳動しても同様です。 泳動は低温室内で100CVで数時間程度、アクリルアミド濃度はグラディエント、ホモジニアス含めて様々試してみました。 検討してみるべき条件など教えていただけたら幸いです。 既成ゲルを試してみるべきなのかもしれませんが、今後の実験デザインを考えると、どうしても自作ゲルでシャープなバンドを得ることが欠かせません

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