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(無題) 削除/引用 No.4219-17 - 2015/06/26 (金) 20:02:30 - AP >RINについては、Drosophilaの試料でも使えるのでしょうか？（28Sのピークはなく、その断片が18Sと重なって現れます） Microarrayを外注すると、受注先はプロトコールにしたがって、受注RNAサンプルの品質試験をBioanalyzerで行って可否を判断するんですが、ショウジョウバエRNAをやってもらった時もRINを見てOKになっていました。

(無題) 削除/引用 No.4219-16 - 2015/06/26 (金) 17:27:12 - shinpe- おお様 吸光度で出た10 ng/uLが出発試料から考えて異常な高値だったためBioAnalyzerを試したら全然違う低い濃度値が出た、というのがこの質問のきっかけなのです。 seventh様 上限5 ngのチップで100-200 pgという値が出たので、定量性は低いとは言えどもそこそこ実際に近い値が出ているのかなーと捉えました。一旦total RNAを抽出する件、検討します。RINについては、Drosophilaの試料でも使えるのでしょうか？（28Sのピークはなく、その断片が18Sと重なって現れます）

(無題) 削除/引用 No.4219-14 - 2015/06/26 (金) 15:27:17 - seventh 今回の場合は色素の影響を受けているっぽいので直接の影響はないでしょうが、RNApicoのレンジは5ngまでです。 余談ですがRNA-seqを行う場合はtotalRNAをとってbioanalyzerのRINで分解がないことを確認したほうが良いです。もし精製法を変更する場合はtotalRNAをとることも視野に入れてみてください。

(無題) 削除/引用 No.4219-13 - 2015/06/26 (金) 15:26:40 - おお 通常のtotalRNAの量から見積もって10ng/ulってあり得る収量ですか?

(無題) 削除/引用 No.4219-12 - 2015/06/26 (金) 15:24:19 - おお うーん実験で使う蛍光物質でさえ吸収で濃度測りますからね。。。

(無題) 削除/引用 No.4219-11 - 2015/06/26 (金) 15:19:17 - shinpe- おお様、AP様 ハエ由来の色素に関するコメントを頂き、ありがとうございます。 実は、蛍光色素ベースでの測定（Qubit）を試したら、測定下限以下でした。やはり吸光度計での結果は吸光度か蛍光かわかりませんが、色素の影響を受けているのかもしれません。いずれにせよ、今のところここで濃度測定の頼りになるのはBioAnalyzerのみになってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.4219-10 - 2015/06/26 (金) 14:42:19 - AP >300nm以下急激に吸収が高くなってますので、 その吸収エネルギーで励起されて、強烈に蛍光を発するんですけれど（学生実験などでクロマトグラフィして蛍光で観察するというのは定番）、分光光度計にかけたときはどっちにふれるんでしょうかね。照射波長はフィルタしているけれど、検出波長側はフィルタしていないので、透過度が上がってみえる？　蛍光があっても散乱するので一筋縄ではいかない？

(無題) 削除/引用 No.4219-9 - 2015/06/26 (金) 14:26:52 - おお ttp://sites.biology.duke.edu/nijhout/images/Ommochromes.pdf xanthommatinなど、蠅の目の色素のようですが、上記のfig1にスペクトルがのってますが、300nm以下急激に吸収が高くなってますので、やはり目の色素がはいっていたら、かなりRNAなどの見積もりはぶれそうです。 ttp://www.biochemj.org/content/398/3/451 こちらのfig 3cの内側にあるパネルにDrosopterin(これも目の成分)の前駆体の吸収がのっているけどUV領域にけっこう強い吸収があります。 グーグルブックでこれリンク張っても見れるかどうかわかりませんけど ttps://books.google.com/books?id=M2_dBwAAQBAJ&pg=PA10&lpg=PA10&dq=Drosopterin+spectrum+uv-vis&source=bl&ots=Sw3ooFiVX4&sig=derkqXEkjy18VNAOPpsIsNiZ0dY&hl=en&sa=X&ei=guGMVdXzLoLfoASjtI_wBg&ved=0CBQQ6AEwAA#v=onepage&q=Drosopterin%20spectrum%20uv-vis&f=false DrosopterinじたいもUV領域に強い吸収がありますね。

(無題) 削除/引用 No.4219-8 - 2015/06/26 (金) 12:56:57 - AP ショウジョウバエの眼の色素はオモクロム系（キヌレニン系）のものとプテリン系のものの混合です。最大吸収波長はそれぞれも490 nm前後です。 それより問題だと思うのは、どちらも紫外域で励起されて蛍光を発するところなんですが。測定値が高く出るという現象とは別かもしれませんが、いずれにせよ正確には測れないと思います。 微量の核酸を定量するとき、蛍光色素ベース(picogreenやQuantiFluor、励起は可視青色域)の方法が夾雑物による撹乱を受けにくく、感度、精度ともよいのでおすすめです。専用の装置がなくても、キュベットまたはプレート式の蛍光リーダーで使えます。

(無題) 削除/引用 No.4219-7 - 2015/06/26 (金) 12:42:47 - おお ああ、あとlight passを2mmと1mmに切り替えれると思うのですが、薄いときは2mmに設定するとある程度ましになるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4219-6 - 2015/06/26 (金) 12:38:15 - おお http://www.nanodrop.com/Productnd2000specs.aspx nanodropの検出限界はDNAで2ng/ul Absorbance Range0.04 - 300 (10 mm equivalent)となってますね。まあ理想状態の場合でしょうけど10ngなら何とかはかれるレンジではないでしょうか? おそらく混入している色素で下駄をはいているのでしょう。UV領域につよい吸収があるものが混入するとうまく測れないのはしかたないですね。もしdownstreamの酵素反応とかで影響がないのならnanodropのあたいで実験を組んでいいのではないでしょうか?影響があるならさらに精製が必要になるでしょうけど、その辺は実際Drosophilaをつかって経験、感触がある人の意見が聞ければいいですね。あの目の赤い色素ってなんでしたっけ?それとも別のものかな?

(無題) 削除/引用 No.4219-5 - 2015/06/26 (金) 12:10:20 - shinpe- seventh様 ご指摘ありがとうございます。 吸光度で測定した値が試料量から予測したよりも異常に高かったため、BioAnalyzerでの解析には同じ溶液（10 ng/uLと測定されたもの）をそのまま用いました。チップはRNA picoで、Eucaryote mRNAのプロトコルでランしています。picoはnanoよりも定量性が低いとは聞いていますが、Electropherogramが比較的きれいでpicoの測定レンジの真ん中あたりの濃度値が出たので、信用してしまいました。 吸光度で正しく濃度測定した試料（の希釈系列）をBioAnalyzerでのコントロールとして用いるのは、良い方法ですね。教えて頂きありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4219-4 - 2015/06/26 (金) 12:00:35 - shinpe- 江戸川サリバン様 早速ありがとうございます。 1. 今用いているのは組織ライセートを直接Oligo(dT)カラムにロードするタイプの精製キットのため、Total RNAの段階を経ていません。 2. A260/A280の吸光度比は見ていましたが、スペクトルを取ったことはありませんでした。今後測定し、核酸の場合と比較してみます。 3. 測定下限（がどことは認識していませんが）に近いため信頼性が低いと考えています。一方、100-200 pg/uLはBioAnalyzerの測定に適した濃度のため、そちらが信頼できるとも考えられます。

(無題) 削除/引用 No.4219-3 - 2015/06/26 (金) 11:54:48 - seventh 10ngはナノドロップで測るには薄いです。 ただし、ライブラリ作成キットのレンジ内なら多少のブレは気にしなくても良いと思います。 Bioanalyzerは定量には向きません。 bioanalyzerは正しく使用しているとのことですが、どのチップを使っていますか。また１ウェルに流すRNAはどの程度の濃度に調整していますか？ Bioanalyzerはラダーの蛍光強度を元に定量を行っているのでラダーに劣化や調整ミスなどがあると定量結果もずれます。キットによってはラダーを事前に希釈する必要があったと思います。 ナノドロップでうまく測れる量のRNAを希釈してポジティブコントロールとして用いることで多少は目安になります。 個人的な経験ですが1ng/ulに希釈したポジコンでもロード時の手技の影響かで0.7から1.5ng/ul程度のばらつきはありました。

(無題) 削除/引用 No.4219-2 - 2015/06/26 (金) 11:44:29 - 江戸川サリバン 1. まずtotal RNAを抽出してからpoly(A) RNAを精製すると思いますが、total RNAの抽出方法は適切ですか？total RNAの純度に問題はありませんか？ 2. 分光光度計はどのような機械を使われているかわかりませんが、スペクトルの波形は正しいものが見られていますか？ 3. A260の実測値が小さすぎて（検出限界に近くて）正確に定量できていない可能性はありませんか？

Drosophila RNAの定量 削除/引用 No.4219-1 - 2015/06/26 (金) 10:37:32 - shinpe- Drosophilaの頭部から抽出したpoly(A)+ RNAをNGS解析の試料に用いようとしています。 吸光度から求めた核酸濃度と、アジレントBioAnalyzerで求めたRNA濃度に大きく開きが出てしまいました。具体的には、どの試料も吸光度測定では10 ng/uL以上の値が出たのですが、BioAnalyzerでは100-200 pg/uLとなりました。BioAnalyzerは正しく使用していますし、mRNA (+ rRNAのコンタミ) を正しく反映した分子量分布が見られているので、こちらの測定結果が正しいような気がしています。一方、10 ng/uLだったとしても吸光度で測定するには薄すぎるのかもしれませんが、A260/A280の値は2.0近くで安定しており、まったく信頼できないわけでもない気がします。 ここで、試料溶液に着色しているのが気になっています。Drosophilaの頭部をホモジナイズした試料なので、常に赤色に着色しています。今回の試料はOligo(dT)ミニカラムを3回通したものですが、それでも目視でわかる程度に着色しています。この色素が260/280/320 nmでの吸光度測定に干渉しているために核酸濃度が実際よりも高く算出されるのでしょうか？ また、この色素を除去する方法などあれば、ご教授ください。よろしくお願い致します。

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