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一度あった 削除/引用 No.4215-22 - 2015/06/26 (金) 10:11:56 - ema インサートの端どうしが丁度ループで引っ付く配列となって、シークエンスすると飛ばしてベクターの結果になったことがあります。

不可解なシークエンス解析結果 削除/引用 No.4215-21 - 2015/06/25 (木) 09:39:24 - tora 皆様ご意見ありがとうございます。 皆様のおかげで納得いく考えが出来そうです。 今回のような拙い質問にご意見いただき皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4215-20 - 2015/06/24 (水) 22:20:21 - おお えっとですよ。ライゲーションされたものができてたとしてですよ、transformationで大腸菌に空のベクターとともに入ったとして、空のベクターがなんらかの形で大腸菌が環状にした状態なら、その時点ではあなたの目的のプラスミドと空のベクターが共存するわけです。でその後どちらかのプラスミドが優位になるのでコロニーは結局singleのプラスミドをもった集団に見えるわけです。じゃあ最初に導入されたライゲーションされたやつはどこに行ったんですか? 大腸菌は壊さないので、その中のどこかにほとんど増えてないけどいるなら、その集団からプラスミドをとると、ごくマイナーではあるけどライゲーションされたやつがいることは察しがつくでしょう。それをPCRでふやしたなら、1コピーからでも増えるので偽陽性が出る可能性はあるっていう考えに及ぶと思うんだけど。 適切な制限酵素がないというけど、ベクターのインサートに近い部分で切る制限酵素を使うならインサートが入っていれば、ベクターだけのサイズより長くなるわけだし、長さがわからないといっても、やっぱりベクターだけの長さよりは長くなるわけだし、なんら制限酵素をつかって確認できない理由はないのではないかと思うんだな。

(無題) 削除/引用 No.4215-19 - 2015/06/24 (水) 20:16:41 - 独り言 おそらくそのPCRポジティブだったものは、ラーゲーション時のインサートのコンタミの可能性が高いと思われる。 ミニプレップ後のプラスミドを、インサート内のプライマーとベクター側のPCRでやり直して（サイクルは２５サイクル）（TAクローニングなら２方向でるので、２つの組み合わせで）、当たりをシークエンスするのが一番だと思う。

(無題) 削除/引用 No.4215-18 - 2015/06/24 (水) 20:07:52 - AP 見事にピントがズレてるなあ。 >ピックアップしたものは確実に白コロニーだったと思います。 と、現に白コロニーを拾ったのでしょう。それでもシークエンスしたらインサートがなかったわけでしょう。 じゃあ、なんで白コロニーだったかシークエンスの結果から原因となった欠失・挿入などの変異が見つかったのか？　と聞かれてるんですよね。 そもそも、現に白コロニーを拾ってもハズレだったんだから、青白選択をあんまりあてにしないほうがいいね。

(無題) 削除/引用 No.4215-17 - 2015/06/24 (水) 18:34:59 - 中年 1.3kbのインサートが入っているのに青コロニーになる可能性はまずあり得ないので考慮しなくとも良いでしょう。 白コロニーの話を出したのは、既にシークエンスを決定されて、それがベクターのセルフライゲーションであったとお書きになっていたので、読めた配列でlacZのフレームがずれていたとすれば、それが白コロニーなのにインサートが入っていなかったことの理由であると言いたかったからです。 精製したプラスミドを鋳型にPCRを行い、さらにそのPCR産物を鋳型にnested PCRをされたとのことですが、その際、調べた複数のクローンは全て同じくらいの量のバンドがでましたか（あるいは調べたクローンは一つだけですか）。もしそうであれば、その実験にはネガコンに相当するものが全く無いわけですから、見えたバンドは（どこかからの）インサートのコンタミに由来すると考えるのが妥当だと思います。

(無題) 削除/引用 No.4215-16 - 2015/06/24 (水) 18:33:18 - mmm インサートの正確なサイズがわからないって、どういうことだろう。 ライブラリーの作製とか？ よくあるクローニングと違うなら、もう少し詳しい情報があってもいいかも。 それにしてもTAベクターのMCSの酵素が使えると思うけど。 「セルフライゲーションと思われる」というのもよくわからない。 もう少し情報は正確に記載しないと、誤解が生じますよ。

不可解なシークエンス解析結果 削除/引用 No.4215-15 - 2015/06/24 (水) 18:18:17 - tora 制限酵素チェックを行わなかったのは、適当な酵素がなかったからです。 インサートについては正確なサイズが分からないので、laczのフレームがずれていないという可能性は確かにあるかもしれません。そのため青コロニー中にインサートが入っているコロニーがある可能性はあります。しかし、インサートのサイズが約1.3kbpあるので立体障害でうまく白コロニーになると思っていました。 アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4215-14 - 2015/06/24 (水) 18:04:14 - 中年 また、コロニーPCRならわかるのですが、調製したプラスミドのチェックをPCRで行う理由はなぜでしょうか。制限酵素で切ってみる方が手間も時間もコストも掛からないと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.4215-13 - 2015/06/24 (水) 17:44:15 - 中年 TAクローニングで白コロニーって、かならずしもインサートのせいとはかぎらないでしょう。シークエンスで得られた配列はベクターのセルフライゲーションだったとのことですが、lacZのフレームは合っていましたか？

不可解なシークエンス解析結果 削除/引用 No.4215-12 - 2015/06/24 (水) 17:30:13 - tora 皆様ご意見ありがとうございます。 まず、コロニーPCRとnestedPCRではインサート配列由来のプライマーを用いました。説明不足ですみませんでした。 nestedPCRは増幅の為ではなく、そのバンドが非特異的なものではないことを確認するために行いました。通常のnestedPCRの利用目的と少し異なっていたので誤解させてしまったようです。 プラスミドはピックアップしたコロニーを寒天培地で培養後に、液体培地で培養したものから抽出しました。 確かに青白選択では青コロニーが8割ほどで、形質転換が上手くいったとは言い難いですが、ピックアップしたものは確実に白コロニーだったと思います。 自分でも今回の様な結果になる理由を考えたのですが、まだ納得できる答えが出ません。 もう少し皆様の考えをお聞きしたいです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4215-11 - 2015/06/24 (水) 16:51:59 - seventh >>toraさん すみません。読み違えてました。 シークエンスとPCRの両方の結果を信用するならセルフのプラスミドに（シークエンシング波形に影響を与えないほど）ごく少量のターゲットのプラスミドが含まれているということになります。 複数のコロニーが混ざっているとか？ もしくはPCRのバンドはセルフのプラスミドでもでる偽陽性なアーティファクトだとか 培養して抽出したあとのプラスミドならテンプレートの影響は考えにくいです。コロニーPCRでは影響しますが

(無題) 削除/引用 No.4215-10 - 2015/06/24 (水) 16:51:38 - AP ああ、ベクター由来のプライマーってシークエンスプライマーのことか。 PCRのプライマーがベクター配列じゃなくて両側インサート配列なら、コロニーの生えていないところをつついてもPCRかかるよ。

(無題) 削除/引用 No.4215-9 - 2015/06/24 (水) 16:49:21 - AP ああ、もちろん、プラスミドを精製したあとは電気泳動して定性的、定量的なチェックは不可欠。始めてクローニングしたものなら制限消化してチェックはするし、チェック済みのクローンから再精製したときも、少なくとも消化しないインタクトを泳動する。消化しなくても、よほど小さいｄインサーえもないかぎり、入ってなければ見分けが付くだろう。

(無題) 削除/引用 No.4215-8 - 2015/06/24 (水) 16:44:44 - たていす ＞コロニーPCRを行い、そのコロニーから抽出したプラスミドでPCRとnestedPCRを行ったということです。 で、その時のプライマーは、ベクター由来の配列を使ったの？使わなかったの？

(無題) 削除/引用 No.4215-7 - 2015/06/24 (水) 16:43:46 - AP >過去の記事にはコロニーをピックアップする際にプレートに残ったテンプレート（ライゲーションされなかったテンプレート）を拾ってしうことがあると書かれていまし ベクター配列に対するプライマーならライゲーションされなかったインサートは増えてこないはず。脱リン酸端が含まれるライゲーションならなおさら。 コロニーPCRでnested PCRをするってのは、ちゃんとわかってやっているのか疑問。そこまでしなければ増えないならハズレだろう。 普段やってる分には、通常サイクルのコロニーPCRで陽性はガッツりバンドが出る一方、偽陽性（おそらく陽性のコンタミ）でも薄く、しかしはっきりとバンドが見えるくらいだったりする。 要するに、出てきたコロニーがすべて、あるいはほとんどがハズレ、コロニーPCR以前の問題で実験がうまくいっていないということじゃないか？

不可解なシークエンス解析結果 削除/引用 No.4215-5 - 2015/06/24 (水) 15:35:58 - tora 皆様アドバイスありがとうございます。 説明不足で誤解を与えてしまったようです。 コロニーPCRを行い、そのコロニーから抽出したプラスミドでPCRとnestedPCRを行ったということです。 なので抽出したプラスミドには目的遺伝子が含まれるはずと考えていました。 しかし、実際にはベクターのセルフライゲーションが起こっていたということです。 シークエンス解析にはプラスミドをサンプルとして用いて、プライマーはプラスミド由来のものを使いました。 過去の記事にはコロニーをピックアップする際にプレートに残ったテンプレート（ライゲーションされなかったテンプレート）を拾ってしうことがあると書かれていました。 それが原因であるとすれば、どうすればよいでしょうか。 何か良い意見があればお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4215-4 - 2015/06/24 (水) 15:35:31 - 独り言 私もnested PCRをまでしないと増えないのか疑問です。 普通はベクター側とインサート側のプライマーでpCRして25サイクルぐらいで増えれば、制限酵素でなくても陽性と判断します。

(無題) 削除/引用 No.4215-3 - 2015/06/24 (水) 14:04:29 - seventh コスト的なものも考えるとプラスミド精製前にコロニーPCRでインサートのサイズを確認したほうがよいかもしれないです。 プライマーの組み合わせによってはサイズ確認だけでなく向きや特異性も確認できますし。 現象自体はよくあることです。バンドのゲル抽出や青白選別を行っても目的外のものを拾ってしまうことはあります。

(無題) 削除/引用 No.4215-2 - 2015/06/24 (水) 12:35:41 - おお PCRだと1コピーあってもふえるからねぇ。。。インサート確認するなら制限酵素使った方がいいよ。なんでnestedPCRが必要なのかよくわからないですけど、、、無駄に感度あげているようなきがしますが、特別な理由があったんでしょうか?

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