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(無題) 削除/引用 No.4214-5 - 2015/06/24 (水) 07:28:02 - 中年 最近…ということなので、以前はそのようなことはなかったということですね。同じホストで同じプラスミドを増やす場合でも以前とは違いますか？ 菌量が少ないとペレットがポロポロします。プラスミドが違うなら、そのプラスミドのせいで大腸菌の生育が悪くなっているせいかもしれません。 解決策としては、おおさんの仰るように遠心前にクロロホルムを一滴入れてひと混ぜすることは試してみる価値ありだと思います。うちではルーチンにそうしています。

(無題) 削除/引用 No.4214-4 - 2015/06/24 (水) 07:27:51 - おお あ、みにぷれっぷですね。ならばフィルターはあまり得策ではないかもしれません。ペレットがベタベタしてないなら系としてはうまくいっているような感触です。

(無題) 削除/引用 No.4214-3 - 2015/06/24 (水) 05:40:53 - h おおさん迅速なご回答ありがとうございます。 フィルターは遠心後に通すのか、あるいはマキシプレップみたいに中和後に直で濾してしまう感じでしょうか…？でもロスもありそうですし用意するのも面倒くさいしで、フィルターは使わないかなぁ、という気がします。 クロロホルムは試してみる価値がありそうですね。系は標準どおり250+250+350 uL (P1, P2, N3)なんですが、5とか10 uLも入れれば十分ぐらいでしょうか。遠心は現状MAXで走らせているので、遠心力上げるのは難しそうです。でも理論上は遠心力を上げればペレットも少しは落ち着きそうですね。 ペレットの質ですが、ドロドロという形容とは全く逆で、むしろパサパサすぎて小さい粒子が浮遊しているような感じです（壁に付いたペレットも容易にぽろぽろとはがれます）。いただいたアドバイスから鑑みるに、酸性が強すぎたり（あるいはアルカリがへたってたり）するんですかね…？その辺いじるのは容易なので、次の機会に色々見てみようと思います。 情報大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4214-2 - 2015/06/24 (水) 05:17:38 - おお コーフィーフィルターなどを使ってこす人がいますね。事情が許せるならクロロフォルムをいれてまぜてえんしんするとペレットが安定するようですが、スケールが大きくなるとそれでも気になる場合があります。遠心を強くできるならそれも手です30000gぐらいとか。 ペレットがどろどろするのは菌体がおおいか、中和が弱いかだと思いますが、中和後のインキュベーションで落ち着くときもあります。

ミニプレップ、中和・遠心後のペレット 削除/引用 No.4214-1 - 2015/06/24 (水) 05:11:19 - h ミニプレップを自家製バッファー（と、ばら売りのカラム。バッファーは、ウェブ検索したら出てくるような一般的なQiagen式の組成です）でやっているんですが、最近P1>P2>N3>10分遠心後のペレットが、ぽろぽろとはがれやすいといいますか、上清をカラムに移す時に、浮遊したデブリも結構な量一緒に吸い込んでしまう、という大変不快な状況に直面しています（たまにきちっとしたペレットになることもあるんですが、大多数が脆いペレットです）。 一応最終的なDNAのクオリティ的には問題なく、シークエンスや続く実験には使えているのですが、カラムに結構な量のゴミを混ぜてしまっているのはどうも気持ち悪いです。 色々と条件を振って自分で確かめるのが確実だと思うんですが、一般論として、ペレットがしっかりしないのはどういった原因が考えられますでしょうか？ 菌体が多すぎ・少なすぎ、P1後の懸濁が過剰・過少、P2のアルカリ性がへたっている・逆にpHが高すぎる、P2後に混和しすぎ・しなさすぎ・待ちすぎ・待たなすぎ、N3の酸性度が低すぎる・高すぎる、N3後に混和しすぎ・しなさすぎ、遠心スピードが速すぎ(14 krpmまで出せる遠心機なのでMAXで回しています)、遠心中の庫内温度が高すぎ(冷却機能のない遠心機なので、遠心後の温度がわりと高くなっています）…等々が影響ありそうなファクターかと思うんですが、特に問題になりそうな可能性の高いステップがありましたらアドバイスいただけるとありがたいです。 「最近」と書いた通り、なぜか以前に比べて脆いペレットの割合がとみに増えている感じです（以前もたまに脆いことはあったんですが、その割合が、1:9が9:1になったぐらいに逆転したような感じです）。特に実験操作は大きく変えていないので、自家製の試薬が原因かなあ、という気がしているのですが…（試薬はその時々で作製者が違ったりするので）。 長々と失礼しました。よろしくお願いします。

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